蛋白质组学及其在兽医学中的应用

摘　要：蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，从整体上对生命载体进行研究，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学技术主要包括双向凝胶电泳、生物质谱及生物信息学。双向凝胶电泳根据蛋白质的等电点和分子质量分离蛋白质，而质谱技术已成为鉴定蛋白质的极为灵敏而迅速的工具。由此得到的肽质量图谱结合准确全面的数据库技术，就使得新的蛋白质或多肽得以鉴定。近年来，蛋白质组研究技术已应用到多种生命科学领域中，在兽医学研究领域中尤其是兽药开发方面也将会有很广阔的应用前景。

关键词：蛋白质组学；兽医学；双向凝胶电泳；质谱

后基因组时代研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息，转移到在整体水平上对生物功能的研究，于是产生了功能基因组学。这一新学科从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述，如在mRNA水平上通过DNA芯片技术检测生物基因的表达模式，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实上并不完全如此，从DNA-mRNA-蛋白质，存在3个层次的调控，即转录水平调控、翻译水平调控及翻译后修饰水平调控。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，不能全面代表蛋白质的表达水平。蛋白质特有的活动规律如蛋白质的修饰加工、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子之间的相互作用等均无法从基因组水平上的研究来获知。因此，对生物功能的主要体现者和执行者――蛋白质的表达模式和功能模式的研究就成为生命科学发展的必然。蛋白质组学研究现已成为生命科学研究领域最活跃的学科之一。

1　蛋白质组与蛋白质组学的概念

1994年，澳大利亚Wilkins等首先提出了蛋白质组的概念。蛋白质组指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。它是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。由于同一基因组在不同细胞、不同组织的表达情况各不相同，即使是同一细胞，在不同的发育阶段和不同的生理条件甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。

蛋白质组学是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分，表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质的功能与细胞的活动规律，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，测定基因表达的蛋白质水平，鉴定疾病、药物对生命过程的机制，解释基因的调控。

2　蛋白质组学研究现状

国外大部分蛋白质组表达谱的研究论文发表于2000年下半年以后，且大多数建立在已完成基因表达谱的基础上，表明在基因组或转录组基础上开展蛋白质组表达谱的研究是一个新的方向。人类重大疾病的蛋白组研究通常采用比较蛋白组分析方法。近年来，蛋白质组技术在研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方而进行了有力的探索，涉及到白血病、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肾癌和神经母细胞癌等，鉴定了一批肿瘤相关蛋白，为肿瘤的早期诊断、药靶的发现、诊效判断和预后提供了重要依据。

在1995年国际上发表第1篇蛋白质组学的研究论文后不久，国家自然科学基金委即酝酿并于1997年设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立”。经过几年努力，我国蛋白质组学技术平台的建设有了飞跃的发展，若干研究单位重点建立了技术平台，并在方法学的跟踪与创新上做了不少工作，使现有技术平台达到了国际先进水平。我国的学者己经在蛋白质分析技术与方法，重大疾病如肝癌、维甲酸诱导白血病细胞凋亡启动模型，维甲酸定向诱导胚胎干细胞向神经系统分化的模型等以及一些重要生理和病理体系的蛋白组成分研究方面获得不少成就。

3　蛋白质组学研究中的主要技术方法

蛋白质组学研究中主要涉及的技术有蛋白质的分离和鉴定、蛋白质结构研究、数据库的应用等方面。

3.1　双向凝胶电泳

在蛋白质的分离鉴定中，双向凝胶电泳(2D-PAGE)在蛋白质组分离中起到了关键作用。双向凝胶电泳是首先用等电聚焦电泳(IEF)根据蛋白质等电点进行分离，然后进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子质量进行分离。

虽然传统的双向凝胶电泳以其高分辨率、较好的重复性和兼具微量制备的性能成为蛋白质组学研究中不可替代的分离方法，但仍有其局限性。如即使是试验条件或操作上的微量改变也会导致2-DE胶不能很好的重现，使得图谱上蛋白质点之间差异表达研究陷入困境。为进一步提高2-DE的重复性及工作效率，荧光差异凝胶电泳(differencein gel electrophoresis ，DIGE)技术应运而生。其优点是：①设有内标，使得多个样本之间可以直接进行量的比较。②使用3种不同荧光染料分别标记内标，避免了不同批次胶与胶之间的误差，反映了蛋白质的真实改变程度，降低了假阳性率及假阴性率。③人为因素干扰少而实现了高通量及试验的准确性。

3.2　生物质谱

质谱(MS)技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。20世纪80年代，蛋白质鉴定的常规方法为Edman降解法测N端序列。该方法费用高、速度慢，限制了在蛋白质高通量研究中的应用。20世纪90年代后，生物质谱得到了迅猛发展。生物质谱根据软电离离子化技术的不同，可分为基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)。此两种方法操作方式不同，但其所获得的信息互为补充。前者以多肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较，进而对蛋白进行鉴定，此法通常被称为多肽质量指纹分析。后者由离子谱推得多肽的氨基酸序列，并依据这些氨基酸序列进行蛋白鉴定，此法较多肽质量指纹分析鉴定更准确、可靠。

当前，蛋白质组学研究中最核心的技术就是双向凝胶电泳-质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。

3.3　数据库

在蛋白质组学研究中，数据库的建立和应用也是一个关键。可以利用的蛋白质结构数据库包括肽谱指纹数据库、氨基酸序列数据库、新生多肽序列数据库、蛋白质质谱分析数据库等。已有相应的工具软件可供研究者使用，用于鉴定蛋白质种类、分析蛋白质理化性质、预测蛋白质可能的翻译后修饰以及三级结构。

3.4　蛋白质组研究技术

二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。以质谱技术为核心，开发质谱-鸟枪法、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等直接鉴定全蛋白组混合酶解产物。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。

4　在兽医学研究中的应用

蛋白质是由基因转录和翻译而成，作为基因的最终产物及细胞中的活性大分子，蛋白质无疑是与疾病相关的主要一员。蛋白质表达水平的改变是与疾病、药物作用或毒素作用直接相关的，因此蛋白质组学在兽医学研究中发挥着非常重要的作用。

目前，蛋白质组学在兽医学研究中最大的应用前景在于药物开发领域，不但能证实已有的药物靶点，进一步阐明药物作用的机制，发现新的药物作用位点和受体，还可用来进行药物毒理学分析及药物代谢产物的研究。MujerCV等利用双向电泳和质谱技术，分析了布鲁菌的蛋白质组及其致病株16M的蛋白表达模式，鉴定了所有表达的蛋白质，并对6种布鲁菌减毒疫苗Revl的蛋白质图谱进行了广泛研究。这为发展疫苗，建立宿主专一性、进化相关性及药物开发奠定了基础。JungblutP R等有关结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分支杆菌(M.bovis)的比较蛋白质组学的研究，对新疫苗的研制和结核病的防制提供了新的思路。

另外，蛋白质组学在兽医学中的应用还包括致病机理的研究。能够在整体水平上研究蛋白质组谱的变化是蛋白质组研究非常明显的优势。用蛋白质组学方法研究疾病发生发展过程中某些蛋白或多肽水平的变化，从而能够了解疾病发生的机理。通过比较蛋白质组学的研究，有助于发现与其致病性有关的基因。Deiwick等通过对有毒株和无毒株的鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)蛋白质组的比较，确定了致病性基因，而且发现了毒力岛2(SPI2)调节子。将蛋白质组学方法用于致病机理研究的例子很多，这里不再赘述。

蛋白质组学是在蛋白质水平上大规模研究基因功能的强有力的工具。相信随着蛋白质组学研究技术的完善进步，蛋白质组学研究将不断深入发展。不仅能为阐明生命活动规律提供物质基础，也能为探讨重大动物疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发等提供重要的理论依据和实际解决途径，从而对兽医学的研究做出重大贡献。