布鲁菌单克隆抗体乳胶凝集试验方法的建立

摘　要：建立了用纯化好的牛布鲁菌(B.abortus)单克隆抗体致敏乳胶的检测方法。通过试验确定了抗体致敏乳胶最佳偶联蛋白量为1.23mg/mL，最佳致敏时间4 h，最佳的乳胶浓度为1%。水样模拟样本的制作，取含1.0×109cfu/mL灭活的B.abortus544A生理盐水菌悬液各1 mL，加入9 mL自来水中，充分混合均匀，各取1mL，土样、奶样模拟样本制作同上。最低检出率水样为3×104 cfu/ mL～1.0×105 cfu/ mL，土样、奶样为5×104cfu/ mL～1.0×105 cfu/mL。

关键词：牛布鲁菌；单克隆抗体；乳胶凝集试验

布鲁菌(Brucella)是一种革兰氏阴性、胞内寄生菌。根据致病性的不同和宿主特异性，将布鲁菌分为6个种，即马尔他布鲁菌(B.melitensis)，牛布鲁菌(B.abortus)，猪布鲁菌(B.suis)，绵羊布鲁菌(B.ovis)，犬布鲁菌(B.canis)和沙林鼠布鲁菌(B.neotomae)。布鲁菌能够感染人和多种动物，引起严重的人兽共患传染病。被感染的雌性动物主要表现流产，雄性动物主要表现不育，人类感染表现为发热，主要为波状热、肝脾肿大等症状，此病已经使世界各国遭受了巨大的经济损失，更重要的是布鲁菌能引起人的感染发病，威胁着公众健康，被一些西方国家列为生物战剂之一。早在1954年美国把猪布鲁菌研发成世界第一个生物武器，所以布鲁菌病的诊断和布鲁菌的检测一直受到世界各国的关注。

从近几年布鲁菌病的流行病学调查分析，在西方国家，人的布鲁菌病主要来源于感染的山羊；东方国家，人的布鲁菌病则主要来源于牛和猪；在城市，布鲁菌病主要来源是动物屠宰场。从发病的临床症状观察，布鲁菌病人不表现发热等明显的症状，呈现隐性感染，这种情况不仅为布鲁菌病的早期诊断带来了极大的困难，而且更有利于布鲁菌病的扩散。所以，急需建立快速、准确的检测方法，以达到早发现、早防治的目的。本文报道一种快速检测牛布鲁菌(B.abortus)的乳胶凝集试验方法。

1　材料与方法

1.1　菌株及试剂

牛布鲁菌544A，菌株光滑，为标准强毒株，是A抗原的代表，从中国疾病控制中心(CDC)购买。胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)。主要缓冲液为磷酸缓冲液(pH7.4)、碳酸缓冲液(pH 9.6)、硼酸缓冲液(pH 8.4),2%碳二亚胺为美国Sigma公司产品，pH4.5的PBS配制，0.1 mol/L乙醇胺、0.11% BSA和乳胶(致敏后)储存缓冲液(0.01 mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，5%甘油，0.01% BSA,0.1%叠氮钠)。10%乳胶直径为0.4 μm的羧化聚苯乙烯乳胶，4℃保存。UV-120紫外分光光度计。

1.2　特异性抗原的制备

LPS和O链抗原的提取、纯化及鉴定。

1.3　单克隆抗体的制备及其纯化

将辛酸-硫酸铵法粗提的单克隆抗体过HiTrap Protein A HP 亲和层析柱得到纯度较好的单克隆抗体。

1.4　单克隆抗体羧化乳胶的制备

取500 μL 10%乳胶原液，用0.1 mol/L pH 9.6碳酸缓冲液10倍的乳胶原液体积洗涤10%羧化乳胶3遍， 10 000r/min离心20 min，弃上清。用0.02 mol/L pH 4.5磷酸缓冲液10倍乳胶原液体积重悬后，洗3遍，10 000r/min离心20 min，弃上清；然后用2%的碳化二亚胺(EDC)10倍乳胶原液体积重悬后，摇床上缓慢摇动，室温作用3 h～4h后离心弃上清；用0.01 mol/L pH 8.4硼酸缓冲液10倍乳胶原液体积重悬洗3遍，离心重悬致500μL；加入等体积不同浓度单克隆抗体溶液，摇床上缓慢摇动，室温下作用4 h；用0.1 mol/L乙醇胺封闭5min后悬浮于储存液中。

1.5　单克隆抗体致敏乳胶最佳条件的筛选

1.5.1　最佳致敏时单克隆抗体加入量的选择　经方阵滴定确定敏感性，选择最佳致敏时蛋白(单克隆抗体)的加入量。经UV-120紫外分光光度计测定蛋白含量；加入蛋白的浓度为Amg/mL，致敏完毕后，上清液蛋白浓度为B mg/mL，偶联蛋白的量C＝A－B。

1.5.2　最佳致敏时间的选择　在确定最佳蛋白(单克隆抗体)加入量的基础上，改变致敏时间，经方阵滴定法确定敏感性，选择最佳致敏时间。

1.5.3　最佳乳胶浓度的选择　在确定上述条件的基础上，改变致敏时的乳胶的浓度，经方阵滴定法来确定敏感性，选择最佳致敏时乳胶浓度。

1.6　乳胶凝集试验操作步骤及其结果的判定

在一块洁净的玻璃板上滴1滴约20 μL待检抗原溶液，再加1滴约20 μL致敏乳胶悬液，用牙签迅速将两者混匀，慢慢摇动玻璃板1min～2 min，使其形成直径为1.5 cm～2.0 cm的液面，在黑色背景下，3 min～5min内肉眼观察，同时设定阳性和阴性对照。＋＋＋＋为100%乳胶凝集，颗粒较大并聚集在液滴边缘，液体完全透明；＋＋＋为75%乳胶凝集，颗粒明显，液体少有混浊；＋＋为50%凝集，颗粒较细，液体较混浊；＋为有少许凝集，液体较混浊；－为不凝集，液滴成原有的均匀乳状。最终以出现＋＋以上乳胶凝集者为阳性。

1.7　致敏乳胶的质量检测

1.7.1　自凝性检验　用等量的GBS、PBS、生理盐水、自来水分别代替待检抗原与最佳条件致敏的乳胶悬液进行反应，观察致敏乳胶的自凝性。

1.7.2　特异性检验　分别与布鲁菌种系较近的大肠埃希菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、沙门菌、胸膜肺炎放线杆菌等抗原与致敏的乳胶进行反应。

1.7.3　重复性试验　批内重复：同批致敏的乳胶置于4℃保存，每隔1个月，检测对照抗原。批间重复：5批不同时间用同一方法致敏的乳胶分别与对照抗原进行反应，观察其稳定性。

2　结果

2.1　单克隆抗体致敏乳胶最佳条件的筛选

2.1.1　最佳偶联蛋白(单克隆抗体)量的确定　紫外分光光度计测定亲和层析的单克隆抗体蛋白含量为1.41mg/mL，偶联蛋白的量、偶联后上清液蛋白含量、致敏乳胶加入蛋白量三者之间的关系见表1，经方阵滴定法确定，当加入单克隆抗体量为1.40mg/mL时，敏感性最高，致敏后乳胶不出现自凝(表1)。

2.1.2　最佳偶联时间的选择　由表2可知，当加入蛋白量(单克隆抗体)为1.40 mg/mL时，偶联时间为约4h，敏感性可达到最高，且不发生自凝(表2)。

2.1.3　最佳乳胶浓度的选择　在确定上述条件的基础上，经方阵滴定法确定，当用羧化乳胶浓度为1%时，偶联率最高，敏感性高，不发生自凝(表3)。

表1　加入蛋白量和偶联蛋白量的关系

Table 1　The relationship of added protein and coupling protein

Note：“＋” shows agglutination itself；“－”shows no agglutinationitself.

表2　偶联时间的选择

Table 2　Selection of the coupling time

Note：“＋” shows agglutination itself；“－”shows no agglutinationitself.

表3　最佳乳胶浓度的选择

Table 3　Selection of the optimal latex concentration

Note：“＋” shows agglutination itself；“－”shows no agglutinationitself.

2.2　致敏的单克隆抗体质量检测

2.2.1　自凝性的检测　致敏的乳胶单克隆抗体与同等量GBS、PBS、生理盐水、自来水不发生反应，说明致敏的乳胶没有自凝性。

2.2.2　特异性的检测　致敏的乳胶不与大肠埃希菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、沙门菌、胸膜肺炎放线杆菌等抗原发生反应。