对抗菌肽的深入研究进展

抗菌肽是指存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽通常由l5～45个氨基酸残基组成，大部分带正电荷。多种生物如细菌、昆虫、植物和脊椎动物体内都含有抗菌肽。由于抗生素耐药性和残留问题的日益突出，抗菌肽作为一种抗生素的替代物，因其没有抗生素的上述缺点而备受关注。

1抗菌肽的分类及结构特点

最初对抗菌肽的分类主要依据其来源，分为微生物抗菌肽、植物抗菌肽和动物抗菌肽。但近年来随着研究的深入，根据抗菌肽结构和三维构象的不同，并且与其组成结合起来，抗菌肽可分为4类：

(1)天蚕素类(cecropins)，不含半胱氨酸残基，不形成分子内二硫键，具有d螺旋结构的线性肽。此类抗菌肽约由30个氨基酸残基构成，分子量4ku左右，它们的一级结构具有较强的保守性，主要有以下几个特点：①N端富含极性的碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸等，并含过剩的正电荷，使抗菌肽呈阳离子特性，有利于和细胞膜上的酸性磷脂负电荷作用而吸附到细胞膜上；②C端通常酰胺化，呈中性疏水性，富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，有利于插入到双层脂质膜中；③两端各形成1个α螺旋，中间连接部分富含有脯氨酸，末端大多酰基化；④大部分抗菌肽在第二位上的氨基酸为色氨酸，它对抗菌肽杀菌活性的高低起重要作用。天蚕素广泛存在于家蚕、柞蚕、果蝇等昆虫体内，也存在于一部分哺乳动物体内，最先从猪小肠中分离出的是cecropinPl。爪蟾抗菌肽(maginins)也是一类具有两亲α螺旋的抗菌肽，存在于蛙的皮肤和胃中。

(2)β折叠型，分子内含有2～6个二硫键，分子量约4～6ku。该类抗菌肽含有半胱氨酸，以防御素(Defensin)为代表，包括α和β两种。α防御素已从人的中性粒细胞、兔的巨噬细胞及鼠的Paneth细胞中分离到，含有29～34个氨基酸残基，通过Cys1―Cys6、Cys2一Cys4、Cys3-Cys53个二硫键保证其空间结构的稳定性。β防御素则存在于不同的上皮组织中，含有38～42个氨基酸残基，含有Cys1―Cys5、Cys2―Cys4、Cys3-Cys63个二硫键，可能参与上皮和粘膜的抗感染防御。

(3)富含脯氨酸或精氨酸的抗菌肽，一般含有15～34个氨基酸残基，一类不含取代基结构，如蜜蜂肽(apidaecin)；另一类含有糖基化位点，如果蝇肽，这些位点与其生物功能密切相关。富含精氨酸的抗菌肽中PRP与PRPP结构对抗菌活性有重要意义。

(4)具有环形结构的多肽，在c端含有分子内二硫键，形成一个环状结构，而N端为线状结构。但牛中性粒细胞分泌的bactenecin则是在分子中部形成一个环链。此类抗菌肽具有较强的抗菌活性。

2抗茵肽的生物学活性及作用机理

2．1抗菌肽的抑菌活性抗菌肽对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有高抑菌活性，如plectasin在体外对肺炎链球菌的杀菌效力与万古霉素和青霉素相当。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌等泌尿生殖道的革兰氏阴性菌群对cecropinPl较敏感；但是铜绿假单胞菌则对FA―LL一37较敏感，其最小抑菌浓度见表1。汪以真等利用微量肉汤稀释法比较了7种抗菌肽与抗生素的抗菌效果，其中cecropinPl和cecropinA对大肠杆菌K88和沙门氏菌有更好的抗菌效果，并且抑菌圈边缘十分清晰，而抗生素的整个抑菌圈都比较模糊且界线不明。

目前的研究表明，其作用机理主要有2种模型：①桶板模型：首先，由于抗菌肽带正电荷，与细胞膜负电荷相互吸引而结合在细胞膜表面；然后，单体的抗菌肽分子形成多聚体，其疏水基团插到磷脂双分子层，以与膜表面垂直的方式排列，形成横跨细胞膜的离子通道，已经证明，fowlicidin-1中16～23号氨基酸残基和其与脂多糖的结合有重要关系；离子通道一旦形成，外界的水分即可渗入细胞内部，细胞质也可渗透到外部，细胞膜崩解而导致细胞死亡。②地毯模型：与前一种机制相比，抗菌肽并不插人细胞膜内部，同样在电荷作用下，抗菌肽在膜表面的展开，像地毯平行排列在细胞膜表面；在疏水作用和分子张力作用下改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽分子也可通过此孔洞进入细胞。

2．2抗菌肽的广谱生物学活性抗菌肽除了具有抗细菌、真菌活性外，还被证明具有抑制病毒和肿瘤细胞的活性。已经证明，蜂毒素可以抑制艾滋病病毒的基因表达，从而抑制病毒的繁殖。某些抗菌肽与病毒衣壳氨基酸序列相似，病毒RNA不能与正常蛋白结合，以此干扰病毒组装。除蜂毒肽等某些肽类外，抗菌肽对正常的哺乳动物细胞无杀伤力，但能使肿瘤细胞线粒体空泡化、嵴脱落，核膜界限不清、核染色体DNA断裂并抑制其合成，细胞骨架也会受到损伤。某些抗菌肽，如fowlicidin-3在浓度为50％的血清或盐水中仍能保持其生物学活性。

3抗菌肽的基因工程

天然抗菌肽主要来自昆虫，但其提取过程甚为复杂。一般需将虫体研磨、离心，上清液再经盐析、葡聚糖凝胶层析等一系列步骤纯化，才能去除其他杂蛋白，而产物浓度和回收率都不甚理想。用基因工程方法可以简化上述步骤，且产量可获明显提高。

3．1大肠杆菌表达系统基于大肠杆菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、也最完善的系统，但运用该系统表达抗菌肽则遇到很多困难，主要表现在2个方面。一是抗菌肽的宿主细胞毒性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性地抑制大肠杆菌等宿主细胞的增殖，从而影响抗菌肽的进一步表达；二是容易被降解。由于抗菌肽本身带有大量正电荷，因而对蛋白酶非常敏感，在表达胞中容易被降解，难以实现大量表达。融合表达是解决上述问题的主要方法。xu等以pTRX为载体，在大肠杆菌BL21中以与硫氧还蛋白(TRX)融合的方式表达了38个氨基酸残基的家蝇肽Mdmcec，目标蛋白用肠激酶切割下来，再用HPLC进行纯化，最后获得了11．2mg／L的产量。但大肠杆菌表达产物均以包涵体的形式存在，需将细胞超声破碎后透析纯化，给后续处理带来困难。

3．2酵母表达系统

3．2．1 酵母表达系统的特点虽然大肠杆菌是目前最为成熟的基因表达系统，但作为原核生物，它不具有真核生物的基因表达调控机制，也不具有对外源蛋白的加工修饰能力。近年来，人们已经将注意力转移至跟大肠杆菌同样具有繁殖快、易于培养、遗传操作简单、可工业化生产等特点的酵母表达系统，并且除了上述优点以外还具有使蛋白折叠、磷酸化、糖基化、酰胺化等修饰能力，避免了蛋白以包涵体形式表达、活性降低等问题。

酵母表达系统中最早使用的是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，曾经用其成功表达过干扰素、胰岛素等外源基因，但在工业应用时其缺点也逐渐显现出来，如培养基成本高、容易发生过度糖基化、质粒丢失、拷贝数下降等。为了克服酿酒酵母的局限，美国Daly等最先发展了以甲基营养型酵母(Methylotrophicyeast)为代表的第2代酵母表达系统。其中巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是发展最为迅速的，最初这种酵母菌是用于生产家畜饲料单细胞蛋白，它可以在以甲醇为唯一碳源的培养基中生长，其细胞中含有醇氧化酶(Alcoholoxydase，AOX)、二羟丙酮合成酶、过氧化氢酶等甲醇代谢途径必须的酶。毕赤酵母表达系统具有多种有利于外源基因表达的优势，与其他系统相比，更加便捷、高效，近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种。美国FDA评价该系统是安全的，并且已有来自于该表达系统的蛋白类制剂获得批准。与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下特点：

(1)巴斯德酵母具有很强的醇氧化酶基因(AOX)启动子，可以严格调控异源蛋白的表达。

(2)巴斯德毕赤酵母有完备的发酵方法，可高密度连续培养，在发酵罐中细胞干重可达100g/l以上，便于工业化生产。

(3)巴斯德毕赤酵母的表达产物表达量较高，并且既可以在胞内积聚又可以分泌到细胞外，而其自身的分泌蛋白非常少，有利于纯化。

(4)异源蛋白借助质粒以单拷贝或多拷贝的形式整合到巴斯德毕赤酵母基因组中，有助于稳定遗传。

(5)巴斯德毕赤酵母翻译后加工过程中的糖基化程度更合理。

当然除了上述优点，目前甲醇酵母表达系统也还存在着一些问题，如某些蛋白的表达量相对较低甚至不能表达；分泌表达产物不均一，存在聚合体、信号肽加工不完全、表达产物降解等。所以在实验中还需不断地摸索。

3．2．2基因的构建及表达目的基因的获得可以从动物体中提取RNA，将其反转录扩增后得到cDNA，利用此方法已经得到猪抗菌肽PR-39基因；或根据抗菌肽氨基酸残基种类和其杀菌活性的相关性，替换某几个氨基酸或将2种抗菌肽基因结合构造杂合肽。如将cecropinBl5和17等位点的氨基酸替换后，其抗菌活性明显提高；cecropin A N端1～7位和MilittinN端5～12位氨基酸杂合后，其产物具有热稳定性和高抑菌活性。目前在巴斯德毕赤酵母已表达的抗菌肽包括：人源抗菌肽LL-37，通过克隆cDNA，得到111bp的重组基因，已在X一33中表达，所用质粒为pGAPZB；来源于中国家蚕的ABP―CM4，在GSll5中以pPICZaA为载体，得到了3．8ku的表达产物；Jin等同样以pPICZaA为载体，在SMDll68中表达了cecropinA和magain-in2的杂合肽。

4抗菌肽的应用前景及需解决的问题

目前，细菌的抗药性突变是一个普遍存在的问题，细菌抗药性的产生是由于突变产生了分解抗生素的酶基因，而这种突变往往改变一个或几个基因就可实现。但抗菌肽主要是通过与细胞膜作用而杀菌，细菌产生膜结构的突变比较困难，其抗药性的产生可能极低，因此抗菌肽在人、兽药方面将会有广泛的应用，其抗病毒和肿瘤的功能也会增加其应用范围。目前抗菌肽药物的开发如表2所示。

将抗菌肽推向市场，还要研究以下几个问题：①抗菌肽的大规模生产问题。由于抗菌肽的天然资源有限，化学合成较为昂贵，基因工程为抗菌肽的生产提供了新的手段，但提高抗菌肽的产量和降低成本是目前研究中的瓶颈。②深入研究抗菌肽结构和功能的关系，为抗菌肽分子设计提供理论依据。如Shin等在cecropinA和maginin2的基础上合成得到的杂合链，得到的杂合肽既有较强的抗菌能力，又有抗真菌能力，且克服了原有的溶血性。③抗菌肽的安全性。目前没有资料表明抗菌肽的体内外毒性，许多天然抗菌肽都有溶血性，并且异源抗菌肽应用于其他动物可能引起过敏反应。此外，在使用过程中应注意的是，革兰氏阴性菌在分解后会释放出内毒素，只有某些抗菌肽如LL-37能中和这种毒素损害；其脂多糖结构的改变也可能引起对抗菌肽的耐受性。并且，在抗菌肽大规模使用后，细菌可能会熟悉这种作用而增加其耐药性。