反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用

摘　要：RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术，该技术通过人为加入DNA基因片段，实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作，为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来，RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展，这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。

关键词：反向遗传学技术；正链RNA病毒；负链RNA病毒；感染性克隆

反向遗传学(reversegenetics)是相对于经典遗传学而言的，因为经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律的，反向遗传学则是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象，与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作(reversegeneticmanipulation)。该技术目前已广泛应用于生命科学的各个研究领域，RNA病毒研究的飞速发展更得益于此。文章介绍反向遗传学技术在RNA病毒研究中的进展情况。

1　反向遗传学技术概述

反向遗传学技术是通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上对其进行体外操作，从而研究病毒结构与功能的方法。感染性分子克隆包括感染性互补脱氧核糖核酸(Complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)和感染性体外转录本。构建感染性cDNA就是通过反转录-聚合酶链式反应扩增RNA病毒基因组的cDNA片段，然后利用其限制性酶切位点，将cDNA片段顺次相连并克隆于合适的载体，获得基因组全长cDNA克隆，以其转染适当细胞，全长cDNA在细胞内转录并包装成感染性病毒粒子。而感染性体外转录本也是运用常规克隆方法获得病毒基因组全长cDNA，在体外进行转录，获得基因组全长RNA，用此RNA转染适当细胞以获得感染性病毒粒子。

获得RNA病毒的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入和互补等手段来研究RNA病毒的基因复制和表达、RNA的自发重组和诱导重组、RNA病毒与宿主的相互作用(如病毒在细胞间的传递机制)等，也可进行抗病毒策略研究，还可用于构建新的病毒载体。感染性分子克隆技术的应用使许多RNA病毒的分子生物学研究取得了很大进展。

Qβ噬菌体是第一个在基因水平上进行遗传修饰的RNA病毒。在研究中发现，包含Qβ噬菌体基因组全长cDNA的质粒在导入细菌后具有感染性，并且能够完成病毒的复制周期。后来，这一技术被用于其他病毒，如脊髓灰质炎病毒和类病毒。随后兴起了另一种技术，将病毒cDNA作为模板用大肠埃希菌或噬菌体的依赖DNA的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，DdRp)进行体外转录，将转录本转染敏感细胞可产生有复制能力的病毒粒子。与cDNA转染法相比，用RNA转染可以产生较好的末端，更接近于野生型病毒RNA序列。这种方法可用于较小RNA基因组或多节段RNA的反向遗传操作。

2　反向遗传学技术在正链RNA病毒研究中的应用

目前，反向遗传技术在RNA病毒的研究中已得到广泛的应用并取得了很大的成就，对于正链RNA病毒来说，该技术是最先得到成功使用的。RacanielloVR等利用含有脊髓灰质炎病毒全长cDNA克隆的质粒转染哺乳动物细胞首次获得了具有感染性的脊髓灰质炎病毒，从而揭开了动物RNA病毒反向遗传学研究的纪元。

由于正链RNA病毒基因组可以作为mRNA来翻译病毒聚合酶，所以只要将其基因组的类似物导入细胞即可组装出具有感染性的子代正链RNA病毒，因此相对比较容易获得成功。小RNA病毒科的脊髓灰质炎病毒，披膜病毒科的麻疹病毒以及黄病毒科的登革热病毒、日本脑炎病毒等先后获得成功。

2.1　正链RNA病毒克隆方法

虽然随着RT-PCR技术的进步，克隆病毒全长基因组相对容易得多了，然而进行5′末端快速扩增法(Rapid amplication ofcDNAends，RACE)和3′RACE仍然是一项极具有挑战性的工作。特别是经验表明，病毒5′末端序列的完整性和真实性对于病毒的感染性是至关重要的。除了必须保证5′末端序列的完整性外，还必须尽可能避免引入非病毒序列，否则会导致子代病毒的感染性急剧降低。有时甚至在5′末端仅延伸了1到2个碱基(一般为G)，就使病毒的感染性完全丧失。研究人员认为造成这种现象的原因可能是这些额外序列可以严重阻碍正链RNA合成的起始。相比之下，病毒对其3′末端的变化比较能够耐受。对大多数病毒而言，在其转录本的3′末端延长30个碱基，并不会明显影响其感染性。此外，病毒基因组中的Cap和polyA等功能结构不仅是必不可少的，而且往往是不可替代的。

由于一些病毒基因组中的某些基因或者结构对于大肠埃希菌具有毒性，使得包含这些病毒全长cDNA克隆的质粒在大肠埃希菌中极不稳定，有的甚至无法复制。最典型的例子是黄热病毒和日本脑炎病毒。包含这些病毒全长cDNA克隆的质粒在大肠埃希菌中复制时，总是发生突变，以致最终不得不通过在体外连接的cDNA片段制备感染性的RNA来绕过上述问题。直到2003年，YunS I等才通过将日本脑炎病毒全长基因组cDNA克隆到人造大肠埃希菌染色体中基本克服该难题。由于口蹄疫病毒基因组中有长达300bp的polyC区，使得包含其全长cDNA克隆的质粒无法在大肠埃希菌中正常复制。ZibertA等将口蹄疫病毒O1K株全长cDNA克隆的polyC区缩短为32个C，然后克隆到一个酵母穿梭质粒上，才最终建立第一个口蹄疫病毒反向遗传学操作系统。

2.2　在正链RNA病毒研究中的应用

在SARS病毒Urbani株全序列发表后，YountB等仅用2个月时间拯救出源自该毒株的含有遗传标记的人工SARS病毒。重组的活病毒与野生型毒株复制效率相当，都可以被一种蛋白酶抑制剂所抑制。SARS病毒反向遗传系统的建立对病毒致病的分子机制探索，疫苗设计和药物治疗有重要意义，并可能为彻底阐明SARS冠状病毒的起源提供一种“病毒重建方法。”

Price B D等把野田村病毒科成员Flock house virus(FHV)引入酿酒酵母，转染FHV基因组双节段(RNA1、RNA2)的体外转录RNA，结果产生了FHV病毒粒子，并且这种FHV可在酵母中持续复制。如果用报告基因替换RNA2的编码区，可以使这种FHV酵母系统获得筛选标志。接着，发展到通过引入诱导型表达载体来启动FHVRNA1的复制，大幅提高表达水平。进一步，含有报告基因的RNA2重组复制子通过转染DNA穿梭载体而获得，并且报告基因作为筛选标志，其表达绝对依赖于RNA1的复制，这样FHV酵母复制系统完全可以接受，有利于进一步分离宿主基因和鉴定与FHV复制相关的病毒自身的顺式作用元件。

3　反向遗传学技术在负链RNA病毒研究中的应用

相对而言，负链RNA病毒的反向遗传学操作技术就显得比较滞后。因为负链RNA病毒裸露的基因组或由其cDNA转录而来的RNA没有感染性。尽管如此，人们仍然得到了一些负链RNA病毒的感染性分子克隆，例如流感病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、副流感病毒等。

对于负链RNA病毒而言，利用反向遗传学技术对其进行人工操作要复杂困难得多。因为负链RNA病毒基因组的复制和包装必须具有精确的5′和3′端，而且此类病毒的最小感染单位是由基因组RNA、核壳蛋白以及依赖RNA的RNA聚合酶蛋白所组成的核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein，RNP)。单独的基因组RNA不具有感染性，只将负链RNA转染导入细胞也就不会产生病毒颗粒。如果细胞的胞浆中存在裸露的负链RNA，再由此转录出裸露的、互补的编码病毒蛋白的mRNA，两者之间就会杂交，从而阻碍基因组RNA装配入RNP，病毒也就不能进行复制繁殖了。负链RNA病毒基因组永远以RNP的形式存在，部分原因就是为了避免基因组与mRNA的结合。

反向遗传学技术首先在不分节段的负链RNA病毒的研究中获得突破。1994年Schnell MJ等成功地从质粒DNA获取了狂犬病病毒。首先，将含编码病毒核衣壳蛋白(N蛋白)和聚合酶蛋白(L和P蛋白)分别置于T7启动子序列控制下的质粒，转染细胞，细胞被预先感染能够表达T7聚合酶蛋白(vTF-3)的重组牛痘病毒，然后将含病毒全长反义基因组(即正链基因组)的质粒转染细胞，病毒基因组上游有T7启动子序列，下游含具有自剪切功能的核酶序列。转染进入细胞的质粒经转录及翻译，核衣壳蛋白组装在反义基因组RNA上，RNP经聚合酶蛋白复制形成含基因组RNA的RNP复合体。基因组RNP转录出mRNA，翻译后，即可形成感染性病毒颗粒。该方法成功地获得重组体狂犬病病毒，这是反向遗传学技术在负链RNA病毒的首次应用。

3.1　负链RNA病毒克隆方法

基因组全长片段的克隆是病毒拯救技术的关键环节，采取“分段克隆”的策略，将病毒基因组各片段顺次克隆到复制严谨性较高的低拷贝载体上。在构建cDNA克隆时，在一处或几处合适的位置上进行沉默突变，这样便于鉴定拯救的病毒。基因组3′末端和5′末端的克隆，采用cDNA末端快速扩增法，因为其克隆的准确性会直接影响拯救效率。为产生准确的3′端，采用带有自我剪切功能的核酶序列的载体，这样转录出的RNA具有准确的3′端。3′端几个到几百个碱基的非病毒序列常使病毒转录本的生物活性降低甚至丧失，但一些病毒在3′端有大于30个核昔酸的额外序列而其转录本仍有感染性。研究发现，5′端转录本序列的正确与否对病毒复制的影响比3′端更重要。5′端冗余的核苷酸常使拯救出的病毒的感染性降低甚至消失，这在植物病毒上尤为明显。但5′端少量多余的核苷酸(一般为1个～3个G碱基)为T7RNA聚合酶适宜的起始序列，会促进转录，提高拯救效率。

3.2　在负链RNA病毒研究中的应用

获得感染性分子克隆后，研究者根据其研究的目的，可采取不同的策略在DNA分子水平上进行操作。体外操作的方法有基因敲除、基因缺失、基因插入、基因置换以及构建嵌合病毒等。PeetersB P等在构建新城疫病毒弱毒La Sota株感染性分子克隆时，将La SotaF0的裂解位点的氨基酸序列(GGRQORL/L)突变为强毒株F0的裂解位点氨基酸序列(GGRQORR/F)。结果发现经过修饰的LaSota株的致病力显著提高。该试验结果直接证明F0蛋白的裂解能力是决定新城疫病毒毒力的一个重要因素。McGettiganJ P等将SPBN G蛋白上第333位的精氨酸替换为E，同时删除了G蛋白胞浆域(cytoplasmicdomain，CD)43个氨基酸从而发展出更加安全的第2代重组狂犬病病毒载体。小鼠免疫试验表明，与第1代SPBN相比，SPBN-Gag对小鼠致死性降低了50%，而其诱导的抗HIV-1Gag细胞免疫应答水平并没有降低。

4　结语

各类非反转录RNA病毒反向遗传系统的建立不仅大大促进其分子生物学研究进程，而且具有巨大的应用价值。应用反向遗传操作技术对病毒基因进行有目的地修饰和改造已让人们对RNA病毒有了更深入的了解，而且在此基础上衍生的反向疫苗学，以及通过构建RNA病毒载体作为新型疫苗或进行基因治疗。总之，反向遗传学操作技术是重要的新兴学科，它的产生与发展必将有力的推动生命科学的发展。