亚洲1型口蹄疫病毒反义核酸双向表达载体的构建

摘　要：用RT-PCR法得到针对FMDV基因组5′非编码区反义基因片段及P12A结构蛋白基因和3C蛋白酶，分别克隆到T载体，测序分析正确后，再将它们分别亚克隆到逆转录病毒载体pQCXIX的克隆位点Ⅰ和Ⅱ中，经酶切和PCR鉴定与测序分析，表明目的基因已正确插入表达载体，构建成了口蹄疫双向表达载体pQC-AS-P12A3C。

关键词：口蹄疫病毒；反义核酸；双向载体

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病毒属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，包括O，A，C，南非(SAT)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Asia1型等7个血清型以及70多个亚型。Asia1型FMDV1958年在我国云南保山地区首次发现，此后十几年间，Asia1型FMDV在云南澜沧江以西地区长期流行。2003年－2005年Asia1型FMDV在我国引起暴发流行，给我国畜牧业造成重大的经济损失。

目前大多数流行口蹄疫的国家采取以计划免疫为主的措施预防和控制口蹄疫，传统疫苗(包括弱毒疫苗和灭活疫苗)在口蹄疫防控中仍占主导地位，但是此疫苗成本高，且存在一定的安全隐患。核酸疫苗因其制备简单，引起的免疫反应更类似于活病毒疫苗，却没有安全隐患，有利于疫苗保存和管理，尤其适用于第三世界国家，所以核酸疫苗被誉为疫苗生物技术的第三次革命。但是质粒核酸导入机体的效率低，外源基因表达水平低，核酸在宿主细胞内持续表达易诱发免疫耐受、自身免疫、过敏反应和超免疫性，而且存在整合到宿主染色体上的隐患。因此，研制安全、稳定、高效的新型口蹄疫疫苗迫在眉睫。反义核酸技术已有20余年历史，技术比较成熟，效果稳定。而且反义核酸技术逐渐从细胞水平发展到临床应用水平，并取得了很好的效果。目前，反义核酸技术已成为治疗感染、肿瘤及炎症等疾病的重要基因治疗方法。据此，本试验构建了含有FMDVP12A、3C编码区和反义核酸的逆转录病毒载体。

1　材料与方法

1.1　毒种

由本实验室保存的Asia 1/JQ株，经BHK-21细胞传代增殖。

1.2　载体及菌种

逆转录病毒载体pQCXIX由本实验室保存提供， JM109由本实验室保存。

1.3　主要试剂

RNA提取试剂盒购自Qiagen公司。限制性内切酶BclⅠ、MluⅠ、EcoRⅤ、EcoRⅠ和BamHⅠ，T4DNA连接酶，DNA凝胶回收试剂盒，质粒提取试剂盒，AMV反转录酶和Taq酶，购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4　引物设计和合成

收集已在GenBank上公布的FMDV基因组全序列，用Oligo6.0设计了3对引物。其中，P1和P2为扩增P1和P2基因的引物，C1和C2为扩增3C基因的引物，S1和S2为扩增AS的引物。P1和P2的5′端分别引入了BclⅠ和MluⅠ的识别序列，C1和C2分别引入了MluⅠ和EcoRⅤ的识别序列，S1和S2分别引入了EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列。还在P1的上游引物的5′端加了起始密码子，在C2的下游引物加了终止密码子。

P1：5′-AATGATCAATGGCGCCGGGCAATCCA-3′，

P2：5′-CTACGCGTTGACATGTCCTCCTGCATCT-3′；

C1：5′-ATACGCGTAGTGGTGCCCCCCCGACTCA-3′，

C2：5′-TACGATATCTTACTCGTGGTGCGGTTCGGGATC-3′ ；

S1：5′-CTGAATTCTTGAAAGGGGGCGCTAGGGT-3′，

S2：5′-TAGGATTCCCTATGAAAGGCGGGCGTCGGG -3′。

引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.5　FMDV总RNA的提取

1.5.1　病毒的增殖与收获　在BHK-21细胞长至单层后，弃去营养液，用无Ca2＋、Mg2＋的Hank′s液洗涤培养瓶壁3次，取0.5mL保存的毒液接种于单层细胞上，于37 ℃吸附1 h，再加入含20 mL/L犊牛血清的MEM维持液，37 ℃下培养48 h～72h，观察细胞病变。约有80%的细胞出现病变时收获病毒培养液，于－20 ℃保存备用。

1.5.2　取上述病毒液，按Qiagen公司的RNA提取试剂盒说明操作，提取总RNA。

1.6　目的基因的获得

1.6.1　病毒RNA的反转录　将提取的总RNA放入用DEPC水处理的Eppendrof管内进行反转录。反应体系为25μL：模板RNA 8 μL， 5×Reverse Transcriptase buffer 5 μL，dNTP Mixture 10μL，引物1 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，轻轻混匀，点击离心，然后放置于42℃的水浴锅中反应1 h.所得的反应液即可进行PCR反应，或于－20 ℃保存备用。

1.6.2　目的基因的扩增 以上述cDNA为模板，用引物P1和P2扩增P12A基因。PCR条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1min,58 ℃ 1 min， 72 ℃ 2 min 30 s,30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增3C的条件：95 ℃ 5min；94 ℃ 1 min,60.1 ℃ 1 min， 72 ℃ 40 s,30个循环；72 ℃延伸10min。扩增AS基因的条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min， 72 ℃ 20 s,30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经凝胶电泳后鉴定。

1.6.3　目的基因的纯化　将上述PCR产物用8 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，将目的带切下，用DNA凝胶电泳回收试剂盒进行纯化。

1.6.4　目的基因的克隆　将纯化回收的PCR产物

克隆到pMD18-T载体，重组质粒经PCR和酶切鉴定后进行测序。

1.7　重组逆转录病毒的构建

对重组质粒pMD18-T-P12A3C及表达载体pQCXIX用BclⅠ和EcoRⅤ双酶切得到带黏性末端的目的基因P12A3C及表达载体，分别经过纯化回收后用T4DNA连接酶进行黏端连接，转化JM109感受态细胞，挑斑后提取质粒经PCR及酶切鉴定正确后测阳性菌测序。经Blast分析序列正确后对所得到的pQC-p12a3c质粒及pMD18-T-AS均用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，得到线性化的表达载体及带黏性末端的目的基因AS基因，分别经过纯化回收后进行黏端连接、转化，挑斑后提取质粒经PCR及酶切鉴定正确后，pQC-AS-P12A3C阳性菌测序。

2　结果

2.1　目的基因的获得

用引物对P1-P2、C1-C2及S1-S2分别扩增得到约2500、670、370bp的目的片段，分别与预计的片段大小相符，说明得到了AS、P12A和3C片段，取PCR产物6 μL，在10g/mL的琼脂糖凝胶上电泳，结果见图1～图3。由图可见，通过RT-PCR扩增的基因P12A、3C和AS产物大小均与预期的相符。将目的基因纯化回收后，与pMD-T连接转化挑选阳性菌进行PCR和酶切鉴定，然后测序，并用blast比较后证明序列正确，同源性最高达到99%。

1.P12A的PCR产物；2.P12A的酶切产物；3.λ-EcoT 14Ⅰdigest

1.PCR products of P12A；2.The RE digestion of P12A；3.λ-EcoT14Ⅰdigest

图1　P12A的PCR和酶切鉴定

Fig.1　Identification of P12A by PCR and RE digestion

1. AS的PCR产物；2.AS的酶切产物；3.DNA标准DL 2 000

1.The PCR products of AS；2.The RE digestion of AS；3.DNA Marker DL 2000

图2　AS的PCR和酶切鉴定

Fig.2　Identification of AS by PCR and RE digestion

1.3C的PCR产物；2.λ-EcoT 14Ⅰ酶切；3.双酶切产物PMD18-T载体和目的片段3C

1.The PCR products of 3C；2.λ-EcoT 14Ⅰdigest；3.The RE digestion of3C

图3　3C的PCR和酶切鉴定

Fig.3　Identification of 3C by PCR and RE digestion

2.2　重组逆转录病毒载体的鉴定

将所获得的含有目的基因AS、P12A和3C的重组逆转录病毒载体pQC-AS-IR-P12A3C分别经EcoRⅠ和BamHⅠ，BclⅠ和MLuⅠ，MLuⅠ和EcoRⅤ酶切后，切下来的片段分别与AS、P12A和3C基因相符，PCR鉴定出现同样大小的片段，证明重组逆转录病毒载体构建成功，结果见图4和图5。

1.λ-EcoT 14Ⅰ酶切；2.双酶切产物P12A和空载体 pQCXIX

1.λ-EcoT 14Ⅰdigest；2.The RE digestion of P12A and vector

图4　重组质粒的酶切产物鉴定

Fig.4　Identification of recombinant by RE digestion

1.λ-EcoT 14Ⅰdigest；2.PCR产物AS；3.双酶切产物AS；4.DNA Marker DL 2 000

1.λ-EcoT 14Ⅰdigest；2.The PCR products of AS；3.The RE digestion ofAS；4.DNA Marker DL 2 000

图5　重组质粒的PCR和酶切产物鉴定

Fig.5　Identification of recombinant by RE digestion and PCR

3　讨论

口蹄疫是目前危害世界养殖业的重要传染性疾病之一。尽管FMDV灭活疫苗已成为防控该病的重要手段之一，但其免疫效果仍不够理想，只能提供短期保护，而且存在病毒灭活不完全和病毒逃逸的潜在危险。后来研制出的新型口蹄疫疫苗，如口蹄疫亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等能够刺激免疫动物产生体液和细胞免疫反应，并具有很好的保护作用，但是其在免疫目标动物后，都会有一段时间的有效抗体的产生期，即免疫空白期，动物在这一时期遇到病毒的入侵往往会造成疫病流行。为了解决这一问题，我们首次提出了动物疫病双向防控的研究思路，即根据口蹄疫基因疫苗的已有研究基础和存在的问题，利用反义核酸能够抑制病毒复制的特点，在逆转录表达载体pQCXIX的不同多克隆位点分别插入一段反义核酸及免疫基因，反义核酸在免疫空白期抑制FMDV的复制，随后免疫基因表达产物诱导机体产生抗体以抑制病毒的复制，因此所构建成的双向表达质粒能在口蹄疫的防控中起双重作用。反义RNA技术作为一种选择性封闭目的基因表达的基因治疗方法，近年来在FMD研究与治疗中迅速发展起来。并且它是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新技术，其在抗病毒育种中的研究已成为热点之一，并已取得了一些成绩。而且反义核酸抑制病毒复制的试验已先后在培养细胞和动物体内获得成功。另外，逆转录病毒载体是第一个被改造用于基因治疗研究的病毒载体，也是目前人类基因治疗运用最广泛的载体。无论体内与体外试验，逆转录病毒载体是在具有分裂功能的细胞中进行基因转移和表达最为成功的病毒载体之一。它将外源基因高效、稳定地整合到宿主细胞基因组中，并随宿主细胞DNA的复制而传给子代细胞，从而使外源基因获得长期、稳定表达。

口蹄疫病毒是单股正链RNA病毒，病毒基因组全长约8.5kb，基因组分为5′非编码区、3′非编码区和一个开放阅读框(ORF)。ORF编码一个多聚蛋白，在自身蛋白酶顺次作用下，裂解为功能性的结构蛋白和非结构蛋白。其中结构蛋白P1在3C蛋白酶裂解作用下，产生具有免疫原性的4种小的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。VP1蛋白是惟一能够刺激机体产生病毒中和抗体的蛋白。5′端S片段长约400bp，与病毒RNA复制起始有关，因此口蹄疫病毒5′非编码区在病毒的复制过程中起着很重要的作用。MayrGA等构建了结构蛋白P1和非结构蛋白2A、3C多抗原腺病毒表达质粒，免疫动物后能诱导T细胞反应和抗体的生成，对动物遭受FMDV的攻击起到保护作用。另外，deFelipeP的研究表明，在两个融合蛋白之间引入FMDV中的18个氨基酸的短肽2A作为两个蛋白之间的连接物，能使2A起到多聚蛋白内部核糖体自身裂解的作用，成功地避免了多聚蛋白的分裂对蛋白酶的依赖。相关的研究在FuderS等的试验中也有报道，基于非结构蛋白2A的自身裂解作用特点，本研究在构建载体时，插入了2A以确保不同免疫原能保持各自独立

的生物学特性。基于以上理论，本试验构建了既含有反义核酸，又含有免疫基因的双向逆转录表达载体，旨在探索双向疫苗制剂的模型，为新型疫苗制剂的研究提供新的思路及技术平台。