中药化学成分的提取、分离与鉴定

中药化学成分的提取、分离与鉴定

    （一）目的
总体了解中药化学成分的提取和分离方法；掌握常用提取法的操作技术；重点学会运用层析法鉴定中药化学成分。
（二）准备
1. 药物  黄芩、黄柏、大黄、八角茴香、薄荷。
60%及95%乙醇、20%石灰乳、10%盐酸、浓盐酸、40%氢氧化钠、冰醋酸、***、6mol/L氢氧化钠、5%氢氧化钠―2%氢氧化铵混合液、氯化钠、正丁醇、醋酸镁、次硝酸铋、冰醋酸、碘化钾、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、石油醚、高锰酸钾、氧化铝、硅胶G、1,8-二羟基蒽醌。
2. 器材  电炉，煤油炉，水浴锅，铝锅，台秤，烧杯，容量瓶（25、125ml），具塞烧瓶，圆底烧瓶（2000、1000、500），三角烧瓶，水蒸汽发生器，冰凝管（直形、球形），挥发油测定器，量筒（1000、100ml），分液漏斗（500、250ml），玻璃板（15×5、20×5cm），新华I号滤纸，pH试纸，铅笔，圆规，直尺，剪刀，电吹风，铁台，固定夹，乳胶管，层析缸，荧光灯（波长2537Å）。
（三）方法和步骤
本实验分3部分进行：首先提取中药化学成分；第二将提取所得的浓缩液进行分离和精制；第三步用层析法鉴定分离所得的化合物是否为某已知化合物（或有效成分）。
1. 中药化学成分的常用提取法  实验分4组进行，每组分别安装4种提取装置，提取时作详细记录。
（1）煎煮法  煎煮一般多用水为溶剂，操作简便，多数有效成分可被提出。但由于水能使多种成分溶解，故不需要的化学成分和杂质等也被提取出来，造成滤过和提取的困难。含挥发性成分及化学成分遇热易破坏的中药，不宜采用煎煮法。
取中药薄片或碎块（黄芩），放入铝锅内，加入10～20倍量水，搅拌，浸润20～30min，直火加热，开始宜用强火（电炉），沸后改用文火（煤油炉），保持煎沸10min。用纱布过滤，得滤汁（头汁）。药渣再加8倍量冷水，按上法煎沸，沸后煎煮30min，滤过得二汁，合并2次煎液，静置，备用。
注意事项
①煎煮不宜用铁锅，最好用陶（或搪）瓷器皿，实验室可用玻璃器皿。
②煎煮前宜加冷水浸泡，有利于有效成分的溶出。
③煎煮时间和次数，随药材性质而定。
（2）渗漉法  渗漉法是在药粉上添加浸出溶媒，使溶媒渗过药粉，由于浸液比重大而向下移动，造成了良好的浓度差，使扩散能较好地自然进行。因此，此法不仅提取效率高，同时节省溶剂。本法不宜用挥发性很强的溶剂，一般常用的溶剂为不同浓度的乙醇、酸或碱性乙醇、酸性或碱性水等。
取中药（黄柏），用研钵研碎，过30目筛，秤取粗粉15g，置烧杯中，加入3倍量的20%石灰乳使其充分湿润和膨胀，浸渍30～60min。取脱脂棉一块，用脱脂纱布包裹，并以溶剂湿润。铺垫于渗漉器底部出口处。然后，分次将已湿润好的中药粗粉，填装于渗漉器内，每填装一层压平，不能有松有紧留有空隙，如此层层填装完毕后，在药粉上面盖以滤纸或纱布，再铺一层干净的玻璃珠轻压，以免加入溶剂时使药粉冲起或飘浮（图4―2）。
药粉填装完毕后，加入溶剂，打开渗漉器下口的螺丝夹，待少量溶剂流出排除筒的空气后，旋紧螺丝夹，将流出的浸出溶媒倒入筒内，并使溶剂液面超过药面几厘米，加盖放置，浸渍24～48h，使溶剂充分渗透和扩散。浸渍一定时间后开始渗漉，渗漉液流出速度一般每2～5ml/min。在渗漉过程中，需要随时添加溶剂，使药材中的化学成分充分浸出。将收集的渗漉液静置24h，滤过，备用。
注意事项
① 药粉在渗漉筒中的松紧及压力的均匀度会影响浸出。松紧不匀使部分药粉不能得到应有的浸取，压力不匀造成浸出不完全或堵塞。
②渗漉过程中，药料上部要始终保持一定量的溶剂，以免药料干裂而使渗漉不全。
　　③渗漉的速度，应依药材的性质，制剂的种类和浸出成分等决定。　　　　　　　　　　　　　　　　
（3）回流法  采用有机溶剂加热提取中药化学成分时，或提取易挥发的化学成分时，为防止溶剂及化学成分的挥发，需采用回流法。回流法提取效率高，速度快，并可节约溶剂。
将药材粗粉（大黄），装入大小适宜的圆底烧瓶中，添加适量的溶剂（95%乙醇）至烧瓶容量的1/2或1/3（但需浸过药面），连接冷凝器，于水浴锅上隔水加热。当沸腾后，溶剂蒸汽经冷凝器冷凝后，又流回烧瓶药粉中，如此回流提取至预定的时间后，滤取提取液，药渣再添新溶剂，反复回流提取2～3次，滤过，合并提取液，回收溶剂，得浓缩液，备用

  注意事项
①溶剂装入烧瓶中的量不可太满（不得超过烧瓶容量的2/3），并在烧瓶中事先装入止沸剂（如玻璃珠等）。回流装置各接口处要严密，以免跑气、漏液。
②多数有机溶剂易燃烧，要注意安全，应在水浴上加热，不可直接用火加热。
③冷凝器的大小，应根据溶剂的沸点和需要回流的溶剂体积而定，要求溶剂蒸汽能冷凝完全。一般不宜采用蛇形冷凝管，以免回流不畅而发生意外。
（4）水蒸汽蒸馏法  水蒸汽蒸馏法，是利用水蒸汽加热中药，使中药中的挥发性成分随水蒸汽一起蒸馏出来。本法常用于挥发油类的提取。
开始时，水蒸汽发生器和盛中药（薄荷）的烧瓶应同时直火加热，至沸腾后烧瓶改用酒精灯小火加热。蒸馏至蒸馏液中无挥发油味时停止。收集馏出液分层备用（图4―4）。
注意事项
①烧瓶应向水蒸汽发生器方向倾斜，以免飞溅起来的泡沫、药渣等进入冷凝器而流入接收瓶。蒸汽发生器的装水量不得超过其容量的2/3。
②中断蒸馏时，必须先将蒸汽发生器和烧瓶中间的三通管下口的螺丝夹打开，使与大气相通后再停止加热，以防止烧瓶内液体回流到蒸汽发生器中。
中国药典中挥发油测定器也是一种水蒸汽蒸馏装置，如果要提取少量挥发油，亦可用此装置。其用法如下：
称取八角茴香80g，捣碎后置1000ml圆底烧瓶中，加蒸馏水700ml，振摇混合后，连接挥发油测定器，并从冷凝管向测定器的刻度部分添加蒸馏水至溢流入烧瓶为止。直火加热至馏出液基本上不呈混浊为止，收集蒸馏液约500ml。
实验完毕，各组将提取所得药液分别装入有塞烧瓶中，贴上组别、制作者姓名、日期。置4℃冰箱中。
2. 中药化学成分的常用分离法  经过提取所得的浓缩液，仍是多种成分的混合物，因此需要进行分离和精制。常用的分离法有：
（1）pH梯度分离  取以上经提取的黄芩浓缩液，用浓盐酸调pH1～2，加热至80℃，保温30min，黄芩素析出，滤出沉淀，加入相当于沉淀物8倍量的水，搅匀，使黄芩素粗品混悬于水中，以40%氢氧化钠调至pH7，再加入等量的95%乙醇。使黄芩素成钠盐溶解，过滤，滤液用浓盐酸调节pH2，充分搅拌，并加热至80℃，黄芩素析出，过滤，以95%乙醇洗涤至pH4，干燥即得黄芩素。
（2）液―液萃取  选用与药液不相混溶的溶剂，使之充分混合接触，以便将药液中有效成分，由原药液中转溶于新溶液中，而杂质或不需要的化学成分，仍留在原药液中，然后将两液分离，以便达到有效成分分离精制的目的。
本实验吸取上次实验所得大黄提取液2ml，置100ml圆底烧瓶中，加冰醋酸8ml，在沸水浴上回流3min，待冷后加***30ml，以棉花过滤到分液漏斗中，并以20ml***分2次洗涤，与滤液合并，在冷却情况下，向分液漏斗中加6M/L氢氧化钠液25ml和5%氢氧化钠―2%氨水混合液25ml，摇振提取，以冷水冷却，放置分层，分出红色的碱水层，收集碱水层。***层再用混合碱液（每次20ml）提取2次，直至***层无色。碱水液储存备用。
（3）盐析  中药的某些成分，可溶于水，但难溶于无机盐的水溶液，用此性质，向中草药提取液的水溶液中，加入适量的无机盐后，这些成分就离析出来。所用盐析剂，除食盐外还有硫酸钠、醋酸钠、硫酸铵等。加入盐析剂的数量随不同品种而异，浓度可配成5%、10%……，等等。
盐析除可提取某些化学成分外，也用于除去某些杂质。
本实验取八角茴香蒸馏液，加食盐使之饱和（每100ml馏出液约加食盐40g），搅动后放置1～2h。将上溶液小心倾出于分液漏斗中（不需带出食盐），加***100ml振摇，待水和***层分离后，分出下层的水，将上层***液从分液漏斗上口转入200ml三角烧瓶中，加无水硫酸钠适量，放置过夜，过滤，将***液移入蒸馏烧瓶中，回收***（切不可用明火），残留物即为八角茴香油。
实验完毕，将分离所得物质储存于具塞瓶中，贴上组别、姓名、日期，置4℃冰箱中。
3. 中药成分的鉴定（纸层析法和薄层层析法）
纸层析法
（1）样品和标准品溶液的制备
①大黄提取液（由上次实验而得）。
②标准品溶液：精密称取1,8-二羟基蒽醌10mg，置25ml容量瓶中，加甲醇于水浴上加热使之溶解，用甲醇调到刻度。
（2）滤纸准备  将供层析用的杭州新华滤纸一张，放在干净的玻璃上，裁成滤纸条（8×30cm）2张，在距纸端约2cm处。用铅笔轻轻划一横线，于横线上每隔2cm处划一圆圈（直径约0.3cm以内）以供点样用，滤纸的另一端打一圆形小孔供悬挂时用。
（3）点样  用毛细管吸取样品溶液分别滴于滤纸上，每点直径不超过0.3cm，每次点后待干（或用电吹风吹干），然后再继续点第二次，一共点4～5次（注意点子不能大，否则有拖尾现象），点完后吹干或晾干，以备层析用。
滤纸：圈1   点大黄提取液
（4）展开剂  乙酸乙酯：甲醇：水=100：16．5：13．5(是质量还是体积比)
（5）展开  先将预先选择好的展开剂（溶液系统）加入标本缸中，加入量以使液层高约1-2cm为度，密盖放置片刻使缸内空气为展开剂的蒸气饱和，即将点有样品的滤纸放入，悬挂在悬钩上，先将滤纸悬挂稍高些离开展开剂液面，让溶剂蒸气先将滤纸纤维饱和，再使滤纸的底边浸入展开剂中约1cm，样品中的各成分即随溶剂的上升而逐渐分开。展开至28cm处，取出纸条，用铅笔划下溶液前沿，然后显色。
（6）显色  用1%醋酸镁甲醇溶液。
（7）结果  显色后用铅笔划下色点的位置，求每色点的Rf值。
样品的Rf值与标准品Rf值对照检识。
显色后，也可放在紫外灯下观察荧光。
（8）作业  根据结果写出实验报告。

        Rf值=起点线至斑点中心的距离/起点线至溶剂前沿的距离

一般说来，在固定的层析条件下，一个化合物的Rf值是个常数，所以它对鉴定成分有重要的参考价值，尤其在有已知物对照的情况下，更是确定一个成分的有力佐证。
薄层层析法
（1）制板  薄层板就是将吸附剂均匀地涂铺在载体上（最常用的是2～３mm厚的玻璃板）使之成一薄层状。欲分离的样品就在这一薄层吸附剂上进行层析分离。
涂铺的方法有干法及湿法两种。
①干法涂铺即称取一定量的吸附剂（常用的氧化铝，本实验用氧化铝6g）堆放在玻片的一端，用两端粘有1～2层胶布的玻棒向前或向后均匀地刮过，使氧化铝在玻片上成一均匀的薄层，这样的薄层板又叫“软板”或“干板”。铺好后可直接点样，用近水平法展开。这种“软板”制作容易而简便，缺点是展开过程要轻拿轻放，显色不方便，不能保存；分离效果有时不如“硬板”好。
②湿法涂铺是将吸附剂加水适量调成糊状，为了使制成的薄层板较为牢固，常在吸附剂中加入适量的粘合剂，最常用的是煅石膏，即成市售硅胶G。薄层糊的调配：称取6g硅胶G，加入2～2.5倍量水。在乳钵中不断搅拌研磨数分钟，至成均匀粘稠的糊状，一般研磨至肉眼观察没有水与吸附剂分离的现象，而且糊的表面有奶油样的光泽即可倾倒在二块玻板上立即涂铺。一般可徒手涂铺，即将玻片置于平台用掀起一边再放下的方法使之反复颠簸，成为均匀平坦的薄层。铺好的薄层板应在数分钟内凝固，厚薄均匀，没有分层，表面光滑，没有凸起的颗粒，不易自玻板上剥脱。一般薄层的厚度以0.25mm为宜。在110℃烘1h，放置干燥器中备用。
（2）样品和标准溶液的制备
①黄柏提取液：取前一次实验所得黄柏渗漉液，测pH在12以上，加10%盐酸调pH为5～6，静置，过滤，取滤液在水浴上浓缩至稠膏状，加3～5倍量95%乙醇，沉淀过滤，取滤液回收（或挥去）。
②大黄提取液（由上次实验而得）。
③标准品溶液
（i）黄连素溶液：取黄连素粉少许，加氯水碱化，放在水浴上除氨，残渣加95%乙醇（加热）使溶。
（ii）1, 8-二羟基蒽醌标准品溶液。
（3）层析
干板
①点样  每板点2点，一点是黄柏提取液，另一点是对照标准品（黄连素液），二点间隔2cm，每点直径不超过0.3cm。
②展开剂  氯仿：甲醇=9：1。
③展开  放于长形层析缸，采用倾斜上行法。
④观察结果  先在紫外荧光灯下观察，记录斑点的颜色、大小、位置，然后喷雾显色。喷以改良碘化铋钾液（见中药化学成分的预试）。与标准品对照记录结果。
湿板
①点样  每板点2点，一点是大黄提取液，另一点是对照标准品（1,8-二羟基蒽醌液）。
②展开剂  乙酸乙酯：甲醇：水=100：16．5：13．5。
③展开  放于标本缸中，采用上行法层析。
④观察结果  先喷以1%醋酸镁甲醇溶液，然后在紫外灯下观察荧光，分别记录供试品与标准品斑点的颜色、大小、位置。