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A选择题
1．下列 不常用作抗凝剂。（B）
A. 柠檬酸钠 B.硫酸钠
C.肝素 D.乙二胺四乙酸
2．ELISA试验中常用底物 最佳？ (C)
A. OPD B. OT
C. TMB D. ABTS
3．斑点-ELISA是指ELISA实验在 上进行，抗原（体）点样呈斑点，反应结果观察斑点的呈色。（A）
A. 硝酸纤维膜 B.玻璃板
C.琼脂 D. 96孔ELISA板
4．分离新城疫病毒时，一般可通过接种 日龄的鸡胚尿囊腔来获取。（B）
A．5-7 B. 9-11
C. 13-15 D. 15-17
5．下列 方法是实验室检查微量抗原或抗体的最敏感的方法？（D）
A.直接凝集 B.单向琼脂扩散
C.金标试纸条 D.ELISA
6．下列哪种方式不适用病毒培养 ? （D）
A.细胞培养 B.组织培养
C.动物接种 D.培养基培养
7、目前实验室禽流感病毒血清学检测、诊断最常用方法是 。(C)
A.中和试验 B.补体结合试验
C.血凝和血凝抑制试验 D. ELISA试验
8、一般保存病毒毒种的最佳温度是 。(D)
A. 37℃ B. 4℃
C. -20℃ D. -70℃
9、 布病试管凝集试验中出现前带现象的原因是 。（B）
A.颗粒性抗原过多 B.血清中抗体过多
C.颗粒性抗原过少 D.血清中抗体过少
10、PCR反应分 三个步骤？（D）
A.变性、解链、退火 B.变性、退火、复性
C.退火、复性、延伸 D.变性、退火、延伸
11、 ELISA有 三种基本反应类型。（A）
A.间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA
B.直接ELISA、阻断ELISA、竞争ELISA
C.夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA
D.捕捉ELISA、直接ELISA、阻断ELISA
B判断题
1、口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体检测方法用于区分感染与免疫动物。动物在感染FMDV后既产生结构蛋白抗体，也产生非结构蛋白抗体，而接种纯化灭活病毒后，几乎只产生结构蛋白抗体。（√）
2、实验室细菌分离、鉴定常用的简单染色法有美蓝染色法、瑞氏染色法、姬姆萨氏染色法、革兰氏染色法。（×）
3、布病试管凝集试验中出现前带现象的原因是由于血清中存在不完全抗体（也有人认为是IgA）竞争抗原而造成抗原抗体比例失调。（√）
4、凡能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释倍数代表1个血凝单位（HAU）。（√）
5、对口蹄疫疫苗多次重复免疫的动物进行非结构蛋白(NSP)抗体检测，出现阳性反应很可能是由于疫苗的纯度问题；由于疫苗制备时痕量NSP的存在，可导致阳性反应。（√）
6、PCR聚合酶链式反应体系的基本成分由耐热的DNA聚合酶、引物、 dNTP、 Mg2+、缓冲液、模板组成。（√）
7、评价疫苗保护率可以通过免疫抗体监测，一般认为疫苗的保护率达到50%以上，认为该疫苗的质量较好，可以有效抵御疾病的侵袭。（×）
8、在对未免疫动物种群进行流行病学调查时，抗体水平应该作为主要的感染依据。（√）
9、提取病原核酸，经氯仿去除蛋白质时，离心后上清应小心操作，靠近沉淀的那层膜，一定不要吸取，以免蛋白质污染。（√）
10、PCR引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。（√）
11、尿素酶试验原理是有些细菌能产生尿酶分解尿素产生氨，使培养基呈碱性，从而通过酚红指示剂变为红色。（√）
12、正向间接血凝试验是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体；反向间接血凝试验是将抗体致敏于红细胞表面，用以检测相应抗原。（√）
13、分子生物学实验室布局应该各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。 （√）
14、革兰氏染色的关键步骤是酒精脱色。（ √ ）
15、培养细菌时，培养基中的营养越多细菌生长得越快。（ × ）
16、链球菌在自然界中广泛存在，所以猪链球菌的培养要求不高，一般培养基都能生长的十分茂盛。（ × ）
17、沙门氏菌在SS培养基上菌落为无色，而大肠杆菌为红色。（ √ ）
18、将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，这就是病毒克隆。（ √ ）
C简答题
1、简述实验室检测的目的与意义？
答：（1）确诊疾病。
（2）检测、监测和流行病学调查。
（3）检测疫苗免疫效果和母源抗体。
（4）疾病检测净化。
2、什么是PCR，有什么特点，扩增反应有哪几个步骤？
答：PCR即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，具有特异、敏感、快速等特点。扩增反应包括3个步骤，变性、退火（复性）、延伸3个步骤。
3、什么叫ELISA，ELISA有哪三种基本反应类型？
答：ELISA是酶联免疫吸附试验，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。基本反应类型有间接ELISA、（双抗体）夹心ELISA(或捕捉ELISA)、竞争ELISA(或阻断ELISA)。
4、正向间接血凝试验和反向间接血凝试验有何不同？
答：正向间接血凝试验是将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体；反向间接血凝试验是将抗体致敏于红细胞表面，用以检测相应抗原。
5、简述禽流感HI试验中非特异反应产生的原因以及消除方法？
答：禽流感HI试验中非特异反应产生的原因是血清中含有非特异性血凝抑制因子，其消除方法包括：（1）受体裂解酶（RDE）处理法；（2）高碘酸盐-胰酶处理法；（3）对于水禽和野禽血清，可采用与高浓度（5％～10％）鸡红细胞混合吸附法；（4）同种动物红细胞处理法。
6、PCR检测过程的污染控制措施有哪些？（请回答2种以上）
答： （1）对实验室进行严格的分区（包括配液区、提取区、扩增区和产物分析区的分区；也包括DNA和RNA提取的分区），以及严格控制物流的方向。例如：各个区的东西不交叉使用（包括白大褂、帽子、手套、板架、移液器、提取设备、提取试剂等）；
（2）严格控制环境：工作过程中尽量防止扩增物的扩散；垃圾等污染物要及时清理；用紫外线消除长片段污染物；实验空隙多通风，降低单位空间中的污染物；实验中严格控制层流；实验中使用帽子和口罩。
（3）设立质控，实验过程的阴阳性对照是查找污染源的很好方法；
（4）分装试剂，大包装的试剂应当分成小包装后使用；
（5）UDG酶的使用，可以有效控制污染物；
（6）其他有效措施。
7、抽提RNA时如何防止降解？（请回答2种以上）
答：（1）保持低温；
（2）尽量减少抽提时间，减少暴露在空气中的时间；
（3）使用DEPC水处理的耗材和试剂；
（4）使用RNA酶抑制剂；
（5）处理组织时，尽量灭活内源的RNA酶；
（6）使用正确的储存条件；
（7）操作过程中带口罩、手套、帽子。
8、请简述口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法的用途和原理？
答：口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法检测针对病毒衣壳蛋白的抗体，可用于不同动物免疫效果的评估工作。
其原理是先将待检血清与一定量抗原结合，占据抗原位点，然后再用已知量的阳性血清与抗原结合，最后通过检测抗原结合阳性血清的多少反推出待检血清中特异性抗体的数量，由于该试验使用酶标抗体不受待检血清来源动物种类的影响，所以适应于各种动物（猪、牛、羊）血清的检测。
9、简述禽流感HI抗体检测方法的用途和原理
答：（1）禽流感HI抗体检测方法的用途主要分两方面：
a、应用标准病毒悬液测定血清中的相应抗体水平
b、应用特异性的抗体鉴定新分离的病毒。
（2）血凝原理因病毒而有所不同，流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时的红细胞凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称为血凝抑制反应。（引自农业部兽医局主办2004年全国动物防疫标准培训班材料）
10、 口蹄疫O型正向血凝试验的试验原理是什么？
抗原与其相对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原抗体复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需要少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。
11、简述细菌鉴定的基本方法（从哪几个方面鉴定细菌）？
答：（1）菌落形态观察：观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。
（2）染色镜检：按照革兰氏染色或瑞氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。
（3）常见的生化鉴定：如糖发酵试验、吲哚（靛基质）试验、淀粉水解试验、V-P试验、甲基红（M、R）试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验、接触酶试验、氧化酶试验。
（4）血清学鉴定：检定抗原型或血清型。
（5）分子生物学鉴定：利用分子生物学手段进行细菌的种属、亚型的鉴定。
（6）动物试验：测定致病性或毒力。
D 问答题
1、间接ELISA方法的主要原理、试验步骤、结果判定方法（可举例说明）
(1)基本原理：把抗原在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品和酶标记物按一定程序反应形成复合物，并加入酶作用的底物;反应终止时，根据定性或定量分析有色产物的量来确定待检样品中的抗体的含量。
(2)试验步骤：抗原包被→洗涤封闭→加待检血清（同时设立阴阳性对照）→反应一定时间→洗涤→加酶标二抗→反应一定时间→洗涤→加底物溶液→反应一定时间→终止反应→判定结果
(3)结果判定：肉眼观察或仪器测定，可以阳性与阴性表示结果、以P/N比值表示结果、以终点滴度表示结果或以标准曲线进行定量测定。
2、请说出兽医实验室常用的血清学抗体检测的试验类型？（请回答4种以上）
答：琼脂扩散试验、凝集试验（或玻板凝集、试管凝集、间接血凝、乳胶凝集）、免疫荧光试验、免疫酶组织化学染色、免疫（过氧化物）酶（细胞）单层试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点ELISA(Dot-ELISA)、补体结合试验、（血清）中和试验、免疫电泳、胶体金试纸等。
3、请说出兽医实验室常用的病原学检测试验类型（4种以上）？
答：病原（病毒、细菌、真菌或寄生虫）分离培养与鉴定、凝集试验（或玻板凝集、试管凝集、间接血凝、乳胶凝集）、（间接或直接）免疫荧光试验、免疫酶组织化学染色、免疫（过氧化物）酶（细胞）单层试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点ELISA(Dot-ELISA)、中和试验、免疫电泳、胶体金试纸、核酸探针、(RT-)PCR、荧光PCR、NASBA、基因芯片、核苷酸序列测定（或分析）。
4、禽流感病毒和抗体的实验室检测方法分别有哪些？各种方法用途分别是什么？（各回答4种以上方法）
答：病毒检测方法有：
（1）病毒（鸡胚、细胞）分离培养与鉴定，用途为直接分离病毒；
（2）免疫荧光法，用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原；
（3）免疫酶法（包括免疫酶组织化学染色法和免疫过氧化物酶细胞单层试验），用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原；
（4）中和试验，用已知阳性血清检测病毒，金标准方法
（5）血凝/血凝抑制试验，用已知阳性血清检测病毒
（6）乳胶凝集试验，用已知阳性血清检测病毒抗原
（7）胶体金试纸，用已知阳性血清检测病毒抗原
（8）ELISA方法，用已知阳性血清检测病毒抗原
（9）RT-PCR（含荧光RT-PCR），用途为检测病毒核酸
（10）NASBA，用途为检测病毒核酸
（11）核酸探针，用途为检测病毒核酸
（12）基因芯片，检测病毒核酸
（13）核酸序列测定，解析病毒核酸
体检测方法
（1）琼脂扩散试验，检测病毒NP和M蛋白抗体
（2）血凝抑制试验，检测病毒HA蛋白抗体，可用于免疫效果评估
（3）神经氨酸酶抑制试验，检测病毒NA蛋白抗体
（4）中和试验，用已知病毒检测血清，金标准方法
（5）ELISA方法，用已知病毒抗原检测特异抗体
（6）胶体金试纸，用已知病毒抗原检测特异抗体
（7）乳胶凝集试验，用已知病毒抗原检测特异抗体
5、口蹄疫病毒和抗体的实验室检测方法分别有哪些？（各回答4种以上方法）
答：病毒检测方法有：
（1）病毒（乳鼠、细胞）分离培养与鉴定，用途为直接分离病毒；
（2）免疫荧光法，用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原；
（3）反向间接血凝法，用已知阳性血清检测病毒及分型；
（4）中和试验，用已知阳性血清检测病毒，金标准方法
（5）双抗体夹心ELISA方法，用已知阳性血清检测病毒抗原
（6）胶体金试纸，用已知阳性血清检测病毒抗原
（7）RT-PCR（含荧光RT-PCR），用途为检测病毒核酸
（8）核酸序列测定，解析病毒核酸
抗体检测方法有：
（1）琼脂扩散试验，检测病毒VIA抗原抗体
（2）正向血凝抑制试验，检测病毒衣壳蛋白抗体，可用于免疫效果评估
（3）液相阻断ELISA试验，检测病毒衣壳蛋白抗体，可用于免疫效果评估
（4）VP1合成肽间接ELISA检测方法，检测病毒VP1蛋白抗体，可用于免疫肽苗的家畜的免疫效果评估
（5）3ABC非结构蛋白抗体ELISA检测方法，检测病毒非结构蛋白蛋白抗体，用于感染与免疫动物的区分
（6）中和试验，用已知病毒检测血清，金标准方法
（7）胶体金试纸，用已知病毒抗原检测特异抗体
（8）补体结合试验，用已知病毒抗原检测特异抗体
6、猪瘟病毒和抗体的实验室检测方法有哪些？（各回答3种以上方法）
答：病毒检测方法有：
（1）病毒（细胞）分离培养与鉴定，用途为直接分离病毒；
（2）免疫荧光法（猪瘟荧光抗体染色法），用途为检测扁桃体等组织以及细胞培养物中病毒抗原；
（3）免疫酶法（包括免疫酶组织化学染色法和免疫过氧化物酶细胞单层试验），用途为检测组织、细胞培养物中病毒抗原；
（4）兔体交叉免疫试验，用以检测是否含有猪瘟病毒的定性依据
（4）中和试验，用已知阳性血清检测病毒，金标准方法
（5）ELISA方法（猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验），用已知阳性血清检测病毒抗原
（6）RT-PCR（含荧光RT-PCR），用途为检测病毒核酸
（7）核酸序列测定，解析病毒核酸
抗体检测方法有：
（1）正向间接血凝试验（IHA），用已知血凝抗原检测特异抗体
（2）中和试验，用已知病毒检测血清，金标准方法
（3）ELISA方法（猪瘟病毒抗原酶联免疫吸附试验），用已知病毒抗原检测特异抗体
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