细菌耐药性产生的分子生物学机理及控制措施

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   自从青霉素问世以来，抗菌药物在临床上的应用取得了令人瞩目的效果。随着抗菌药物的广泛应用，细菌耐药性也随之。近年，由抗菌药的使用不当而引发的耐药细菌也越来越多，耐药范围越来越广，程度越来越高，多重耐药菌株不断出现，并且耐药性可通过食物链转移到人群，从而极大地危害人类自身的安全。本文将对细菌耐药性的产生机理以及耐药性的控制措施进行如下阐述。

1　细菌耐药性产生的分子生物学机理

　　1.1　细菌产生破坏药物结构的灭活酶

　　这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多种灭活酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的药物，使之失去生物活性，这是引起细菌耐药性的最重要的机制。该酶主要有β­内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶、乙酰转移酶、红霉素类钝化酶等。

　　1.1.1　β­内酰胺酶(β­lactamase)　这是细菌对β­内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因。该类酶可以是染色体介导，也可为质粒介导。前者通过改变β­内酰胺类抗生素的作用靶位即青霉素结合蛋白(PBP)；后者通过水解和非水解方式，使β­内酰胺环的酰胺键断裂而使抗生素失去抗菌活性。Bush等将β­内酰胺酶分为4型，Ⅰ型是不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶(AmpC酶)，Ⅱ型是能被抑制剂所抑制的β­内酰胺酶，Ⅲ型是不被抑制剂(乙二胺四乙酸和对甲酸除外)所抑制的金属β­内酰胺酶，Ⅳ型是不被克拉维酸抑制的青霉素酶。以第Ⅰ、Ⅱ型尤为重要，Ⅰ型酶为染色体和质粒介导产生的AmpCβ­内酰胺酶，质粒介导的AmpC酶，其AmpC没有调控基因，呈持续高表达，按染色体起源分为5个家族：①枸橼酸杆菌起源的LAT族；②未知起源的FOX族；③阴沟肠杆菌起源的Entb族；④摩氏摩根菌起源的Morg族；⑤蜂房哈夫尼菌起源的Haf族。染色体介导的AmpC酶分为4种：①Ia诱导型，见于阴沟肠杆菌；②Ib持续型，见于大肠埃希菌；③Ic诱导型，见于普通变形杆菌；④Id诱导型，见于铜绿假单胞菌。Ⅱ型酶是由质粒介导产生的超广谱β­内酰胺酶(extended spectrum β­lactamases，ESBLs)， 至2007年11月20日全国已发现ESBLs有500余种[1]，根据编码基因同源性的不同分为TEM、SHV、CTX­M、OXA和其他5类。

　　1.1.2　氨基糖苷类钝化酶　细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药性的最重要的原因就是产生了对这一类药物的共价修饰酶。该酶分为3类，即乙酰转移酶(AAC) 、磷酸转移酶(APH)和腺苷酸转移酶(AAD)。它们能将氨基糖苷类抗生素的游离氨基乙酰化、游离羟基磷酸化或核苷化，使药物不易进入细菌体内，也不易与细菌内靶位(核糖体30 S亚基)结合，从而失去抑制蛋白质合成的能力。已发现的基因型已超过30种，其中G－杆菌以aac(3)­Ⅰ、aac(3)­Ⅱ、aac(6′)­Ⅰ、aac(6″)­Ⅱ、ant(3″)­Ⅰ、ant(2″)­Ⅰ基因为常见；G＋球菌以aac(6′)/aph(2″)、aph(3″)­Ⅲ、ant(6)­Ⅰ基因为常见。Robiscek A等[2]证实了质粒介导的氨基糖苷类抗生素乙酰转移酶AAC(6′)­Ib­Cr对喹喏酮类药物有活性，首次发现了由一种基因编码的酶对两类结构不同的抗生素底物同时有活性的现象。

　　1.1.3　氯霉素乙酰转移酶　此酶为一种胞内酶，由cat基因家族编码，其表达产物修饰氯霉素使之失活。

　　1.1.4　红霉素类钝化酶　此酶是一种体质酶，由质粒介导。包括：①红霉素酯酶：肠杆菌可携带ereA基因和ereB基因表达红霉素酯酶使红霉素酯解失活；②红霉素磷酸转移酶：由mphA，mphB和mphC基因编码，其表达产物可使红霉素脱氧二甲胺己糖C­2′位置发生磷酸化或糖基化而失活[3]；③维吉尼亚霉素酰基转移酶：此酶在葡萄球菌中由vatA、vatB、vatC编码，在肠球菌中有vatD、vatE编码。其表达产物对维吉尼亚霉素活性有修饰作用。

　　1.2　靶位的改变

　　药物作用靶位改变后会使其失去作用位点，从而使药物失去作用。研究表明，大环内酯类耐药菌可通过erm基因编码核糖体甲基化酶，使位于核糖体50 S亚单位的23 S rRNA的腺嘌呤甲基化，导致抗菌药物不能与其结合部位结合[4]。至今为止，已检出erm基因20余种，常见的有ermA、ermC、ermAM[5]；细菌的16 S rRNA基因发生突变时，氨基糖苷类药物将对其失去作用；喹诺酮类药物主要作用于细菌的DNA回旋酶或拓扑异构酶Ⅳ而起抗菌作用，当编码DNA回旋酶的gyrA(突变部位集中在Ser83附近)、gyrB基因，编码拓扑异构酶Ⅳ的parC、parE基因突变时，通过其表达产物的构象改变而导致耐药，由此研究者提出了突变抑制浓度(mutants prevention concentration，MPC)的概念[6­7]。肺炎链球菌可通过其青霉素结合蛋白基因(pbp1A、pbp2B)突变，对青霉素类药物产生耐药[8]。

　　1.3　细菌生物被膜的形成

　　细菌生物被膜(bacterial biofilm，BBF)是指细菌黏附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。细菌形成生物被膜后，往往对抗菌药物产生耐药性，其主要原因有：①细菌生物被膜中的胞外多糖起屏障作用，可减少抗菌药物渗透；②吸附抗菌药物钝化酶，促进抗菌药物水解；③细菌在生物被膜下代谢低下，对抗菌药物敏感性降低；④生物被膜的存在阻止了机体对细菌的免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药物的协同杀菌作用[9]；⑤生物被膜的形成有利于抗生素外排泵的合成[10]。能形成细菌生物被膜的临床常见致病菌有铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌等。

　　1.4　阻碍抗菌药向细菌内的渗透

　　细菌细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变，使抗菌药无法进入细胞内达到作用靶位而发挥抗菌效能，这是细菌自身的一种防卫机制。该类细菌主要见于革兰氏阴性菌，与其细胞壁的结构有关。细菌发生突变失去某种特异孔蛋白后即可导致细菌耐药性，如大肠埃希菌由于外膜蛋白F(OmpF)的缺失，OmpC的增多(有时下降)致使某些药物失去抗菌作用[11]，引起OmpF缺失的机制主要是由于细菌染色体的mar区基因突变所致。大肠埃希菌mar基因位于细菌染色体34分位处，mar位点以maro为中心，包含2个操纵子，其中maro是mar的调控区，它包含有转录启动子和MarA、MarR蛋白结合位点。

　　1.5　主动外排系统(外排泵)

　　细菌细胞膜上存在一类蛋白，在能量支持下，将药物选择性或非选择性地排出细菌细胞外，此过程称为主动外排系统亢进，从而使达到作用靶位的药物浓度明显降低而导致耐药[12]。

　　与细菌多重抗菌药耐药性有关的主动外排泵系统主要归于以下5个家族/类[13]：①ATP结合盒转运体类[ATP­binding cassemembrane affinity filtration(ABC)transporters，ABC类]；②主要易化超家族(major facilitator superfamily，MFS类)；③药物与代谢物转运体家族[drug/metabolite transporter (DMT)superfamily] ，此类外排转运体中与细菌耐药性相关的是一类“小多重耐药性(small multi­drug resistance，SMR类)”外排泵；④多重药物与毒物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion，MATE)；⑤耐受­生节­分裂家族(resistance­nodu1ation­pision[RND]family，RND类)。以上各类转运体中除ABC类以ATP水解能量驱动外排泵外，其余各类均以质子驱动力为能量，并形成质子与药物的反转运体。

　　近年已研究了多种细菌的主动外排系统，如大肠埃希菌RND多重药物主动外排泵系统AcrA­AcrB­TolC[14]，并且在对多重耐药大肠埃希菌的研究中发现其存在四环素和水杨酸钠的主动外排系统[15]，铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB­OprM、MexCD­OprJ 、MexEF­OprN[16]，枯草杆菌细胞膜上Bmr等主动外排系统[17]。药物的主动外排系统已被认为是导致细菌对多种抗生素产生耐药性的重要原因之一。此外，整合子属可移动基因元件，能携带重组的基因盒插入到转座子或接合性质粒中，在不同的细菌间运动而传播耐药性，同时一个整合子可以捕获多个基因盒， 使细菌产生多重耐药[18]。

2　控制细菌耐药性的主要措施

　　2.1　一般性措施

　　2.1.1　对疫病做出准确诊断，合理使用抗菌药。这就要求基层兽医人员提高诊断技能和加强相关医疗知识，对症下药。掌握用药常识，先窄谱后广谱，先一线后二线的给药顺序及联合用药，应严格控制抗菌药物的滥用，对非细菌感染性疾病不要盲目的使用抗菌药。在使用抗菌药治疗疾病前，有条件的应作药物敏感性试验，科学的选择高敏、低毒的药物。

　　2.1.2　在养殖生产中，尽量做到不用抗菌药物来预防疾病，应提高动物机体免疫力，通过其自身来抵御疫病的感染。

　　2.1.3　加强兽药管理，严厉打击假药和劣质产品。兽药生产企业应严格执行GMP标准，兽药经营企业应取得GSP认证。

　　2.1.4　严密监测抗菌药的耐药性，提供耐药性流行资料。一经发现耐药性，应减少该类药物的使用，甚至停止使用。

　　2.2　药物本身的改进

　　2.2.1　采用中药手段消除R质粒，控制细菌耐药性　中药具有副作用小、不易产生耐药性的特点，从中药中选择用于体内的R质粒消除剂，对于控制细菌耐药性的传播与中药的开发利用都具有十分重要的意义。中药体外作用表现为单一耐药性的丢失，体内作用却表现为多重耐药性的丢失[19]。单味中药的质粒消除率要低于复方，可能是使用性能功效相似的同类药物组成复方起到协同作用，增强药物的疗效[20]。罗音久[21]对大肠埃希菌环丙沙星耐药性的消除进行研究，结果发现紫花地丁提取物对大肠埃希菌环丙沙星耐药性有消除作用。

　　2.2.2　寻找不使用抗生素来治疗细菌感染的新策略　①破坏耐药基因，使耐药菌恢复对抗生素的敏感性；②开发抗菌肽，因其独特的生物活性以及不同于传统抗生素的特殊作用机理，已引起人们极大的研究兴趣；③研发更多特异性强的细菌疫苗。

　　2.2.3　研制和开发新的抗菌药物　根据细菌耐药性的发生机制及其与抗菌药物结构的关系，寻找和研制具有抗菌活性，尤其对耐药菌有活性的新抗菌药。如采用纳米技术等新技术，提高药物的靶向作用及缓释性等特性，以加强新型抗生素及其复合制剂的研究。

　　2.2.4　开发利用噬菌体制剂　不同种类的噬菌体溶菌机制存在着差异，具有大基因组的噬菌体依靠hollin蛋白­内溶素系统[22]，而小基因组的噬菌体仅编码一种溶解蛋白，可起到类似于青霉素样的作用，通过阻碍细胞壁的合成而杀菌。

　　2.2.5　研制细菌的颉颃剂　①灭活酶抑制剂。已有3种β­内酰胺酶抑制剂，包括克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦，它们都具有β­内酰胺环，可以与β­内酰胺酶竞争性结合，保护青霉素和头孢菌素类药物不被灭活，但其本身抗菌活性却极小，常与其他抗菌药物合用；②膜通透剂。一些抗生素如多黏菌素、氨基糖苷类和大环内酯类通过破坏细菌细胞膜的完整性，增加膜的通透性而达到抗菌作用；③外排泵抑制剂。Marquez B等[23]从麻疯树属植物的根茎中提取得到化合物，属于吡啶二羧酸酯类，对金黄色葡萄球菌中的NorA泵有较好的抑制作用， Maria R F等[24]从25种巴西传统植物中提取得到的9个化合物，对耐药的金黄色葡萄球菌有较高活性；喹诺酮类药物外排泵抑制剂MC­207110，能明显抑制铜绿假单胞杆菌的Mex外排泵系统和大肠埃希菌的AcrAB外排泵系统；13­CPTC是四环素(TC)的衍生物，能竞争性地与细菌B型四环素外排泵[Tet(B)protein]结合，阻断Tet(B)与TC结合，从而避免细菌将TC排出胞外；④细菌生物被膜抑制剂。司帕沙星对生物被膜具有较好的通透性，且其杀菌作用不依赖细菌的生长率，故对生物被膜内细菌具有良好的清除作用，是治疗细菌生物被膜感染的良好选择。克拉霉素可抑制铜绿假单胞菌BF的形成，并可增强环丙沙星对有BF的铜绿假单胞菌的杀菌作用。