产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定之深入研究|微生态前沿
笔者利用溶钙圈法及牛津杯双层平板法，从欧洲萨拉米香肠、新疆奶酪、自发酵泡菜和韩式辣白菜中分离筛选产细菌素的乳酸菌，通过形态学、16S rDNA将菌株鉴定到种，并对其细菌素基因进行克隆，确定细菌素种类。
1. 乳酸菌的初筛本实验从不同样品中共计筛得206株菌具体来源及菌株数详见表2。筛选出菌株的菌落基本都呈现乳白色或微黄色，单菌落大小不一但差别不大，均湿润、光滑、边缘整齐，发酵培养基无不良气味，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶实验阴性，有较大而透明的溶钙圈，初步鉴定均为乳酸菌( 图1) 。
2. 复筛利用牛津杯双层平板法从分离得到的206株乳酸菌中筛选出12株对金黄色葡萄球菌有抑制效果的菌株，其中来源于萨拉米香肠( SA) 和新疆发酵干酪( N) 编号为SA102，SA104，N105，N107，N108 的五个菌株抑菌效果较明显( 表3) ，作为下一步实验用。
3. 产细菌素菌株的确定3.1 酸排除实验不同pH条件下MRS液体培养基的抑菌效果见表4，结果表明无发酵液的培养液在pH4.0以下具有一定的抑菌效果，pH4.5以上的条件下对致病菌失去了抑菌活性，说明乳酸的抑菌pH范围在4.0以下，因此选择pH4.5为酸排除的临界pH。将发酵液调至pH = 4.5，以金黄色葡萄球菌( G+ ) 和大肠杆菌( G－) 为指示菌，抑菌效果见表5。SA102、SA104、N105、N107、N108 五个菌株在排除酸的作用下仍然具有显著的抑菌活性，而相同pH的乳酸水溶液则无抑菌效果，因此可以判断五个菌株发酵液中存在除酸以外的抑菌活性物质。3.2 过氧化氢排除实验将pH4.5的5株实验菌的上清发酵液经过氧化氢酶处理，观察测量酶处理前后抑菌圈大小，实验结果如表5所示。去除过氧化氢后，发酵液抑菌直径没有显著变化，排除过氧化氢的抑菌效果。3.3 蛋白酶敏感性实验检测木瓜蛋白酶和复合蛋白酶对乳酸菌发酵上清液抑菌活性的影响，抑菌结果见表5，结果表明5个菌株的发酵上清液中的抑菌活性物质对蛋白酶敏感，上清发酵液中抑菌物质为蛋白质类。以上结果可以初步推断发酵液中起抑菌作用的物质为细菌素。
4. 16S rDNA 菌种鉴定对乳酸菌菌株的PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物分子量大约为750 bp左右。将所测序列在NCBI中用BLAST 搜索引擎进行比对，得到与其同源的基因序列，并用MEGA软件对这些序列进行分析，以菌株SA104为例，构建系统进化树如图2所示。由图可知，菌株SA104与Lactobacillus plantarum gp1在同一分支，说明它们的同源性最高，故可确定菌株SA104为植物乳杆菌属的一个种。5个菌株的鉴定结果见表7。
5. 菌株产细菌素基因克隆通过设计并合成7 对细菌素合成相关基因的特异性引物，以SA102、SA104、N105、N107、N108 菌体基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，SA102、SA104、N105 未扩增出特异性片段，只有菌株N107、N108 以plaKF/R 为引物的PCR 产物大小与预期片段长度相同( 图3) ，说明菌株N107、N108基因组DNA 中含细菌素的编码基因。将PCR 产物纯化测序后进行NCBI 比对，分析结果表明得到的该片段存在2 条全长为146、149 bp 的开放阅读框，与Lactobacillus plantarum NC8 的PlnJ，PlnK 基因同源性达97.95%和98.62%( 图4) ，所编码的成熟肽与Plantaricin J 相差1 个氨基酸，与PlantaricinK 序列完全相同，说明菌株N107、N108 基因组DNA 中含IIb 类双肽细菌素PlantaricinJK 的编码基因。
6. 酸碱条件对发酵液抑菌能力的影响由表8可知，5个菌株产生的细菌素在较低pH条件下才表现活性，并且随着pH升高，抑菌效果明显下降，当pH高于5.0时，抑菌物质活性被破坏。
7. 温度对上清发酵液抑菌物质稳定性的影响由表9可知，5个菌株产生的细菌素都对热较为稳定，在50、70℃热处理30min也不会降低抑菌活性，但是当温度达到100、121℃时，抑菌活性发生一定程度下降。
8. 结论本研究利用溶钙圈法及牛津杯双层平板法从来自不同地区的香肠、奶酪及泡菜等多类样品中分离纯化得到206个菌株，通过排酸、过氧化氢及蛋白酶实验后获得5个能产细菌素的菌株SA102、SA104、N105、N107、N108，经16SrDNA 鉴定这5个菌株2株为乳酸乳杆菌3株为植物乳杆菌。通过设计细菌素特异性引物对5个菌株细菌素编码基因进行PCR扩增，结果显示植物乳杆菌N107、N108 同时含有PlnK和PlnJ基因，属于产Ⅱb类细菌素菌株。随后，对发酵液中细菌素粗提物的酸碱稳定性和温度稳定性进行了初步探究，发现其对pH高于5.0的环境不耐受，对热的稳定性相对较好，121℃热处理30 min后菌株仍保持较好的抑菌活性。参考文献 刘英丽,丁立等.产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定.食品工业科技，2017,17(38）:146-152 ］Molinaro S，Romero M C，Boaro M，et al.Effect of nanoclaytype and PLA optical purity on the characteristics of PLA－based nanocomposite films［J］. Journal of Food Engineering,2013,117( 117) : 113－123.
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