抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体（PEDV-IgY）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）为冠状病毒科的成员，与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染引起的临床症状和病理变化极为相似，该病原可致各种年龄的猪发病，其特征症状为呕吐、腹泻和脱水，本病呈地方流行性，仔猪有较高的发病率和死亡率，给某些养猪场">养猪场带来严重经济损失。

对曾发生过该病的猪场或接种过PEDV弱毒疫苗的妊娠母猪，仔猪主要通过初乳获得对PEDV的抵抗力，母源抗体消失后的断奶仔猪常出现顽固性腹泻，而一旦暴发猪流行性腹泻，目前尚没有特别有效的防治措施。鉴于卵黄抗体与初乳作用机理相似，都是通过被动免疫途径达到对仔猪的保护，因而研制抗PEDV卵黄抗体，应用于发生PED的猪场，对防止PED的流行及降低该病造成的损失将具有重要意义。

本试验利用一株猪流行性腹泻病毒分离株，制备免疫原免疫产蛋鸡，收集高效价卵黄，分离提纯卵黄抗体，用于PED的治疗和预防，从而为防治PED研制一种疗效显著、使用方便、易于大量获得且无环境污染的生物制剂。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和细胞 猪流行性腹泻病毒分离株来自中国农业大学兽医学院；增殖病毒用Vero细胞，由本室保存。

1.1.2试验试剂 培养细胞用培养基和血清购自GIBCO BRL公司；弗氏佐剂购自中国兽药监察所。

1.1.3试验动物 120日龄待开产非免疫蛋鸡,购自中国兽药监察所；1日龄未吃初乳仔猪购自京郊某猪场。

1.2方法

1.2.1PEDV在猪体内增殖 1日龄未吃初乳仔猪人工哺乳，PEDV口服攻毒，出现腹泻24小时后剖杀，取小肠组织用于提取和纯化PEDV。

1.2.2PEDV提取与纯化 刮取小肠内壁组织及内容物充分研磨，加10倍体积PBS稀释，反复冻融3次后离心，取上清液用PEG6000进行纯化并浓缩，经0.22μm微孔滤膜过滤后即为提纯PEDV。

1.2.3 PEDV在细胞上增殖 培养Vero细胞，细胞单层长至75%以上时，接种提纯PEDV并加入50μg/mL胰酶以助病毒吸附，若72小时后细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞盲传下1代，盲传至第5代出现CPE，此时收获病变细胞，反复冻融3次后离心取上清液，最后对病毒上清液进行浓缩备用。

1.2.4免疫 浓s病毒液经0.5%甲醛灭活后与等量弗氏佐剂乳化作为免疫原。首免前5日用破伤风类毒素等混合制剂对每只鸡胸肌多点注射0.5mL，以刺激机体免疫反应。首免免疫剂量1mL，胸肌多点注射；分别间隔两周进行二免和三免，免疫剂量增至1.5mL和2mL。

1.2.5抗体效价检测 二免后1周开始，每周采血和收集卵黄，应用琼脂扩散试验检测血清抗体和卵黄抗体效价，比较二者的变化动态，至卵黄抗体效价达到1∶64时收集卵黄。

1.2.6卵黄抗体提纯 无菌收集高效价卵黄，先后加入2倍体积生理盐水和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和36%硫酸胺沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的生理盐水中，4℃透析24小时，即为提纯卵黄抗体。

1.2.7提纯卵黄抗体检测 应用BCA Protein Assay Kit（购自Pierce公司）测定卵黄抗体的蛋白浓度；卵黄抗体纯度通过SDS-PAGE蛋白质电泳检测；而卵黄抗体的效价用琼脂扩散试验检测。

1.2.8卵黄抗体抗病毒活性测定 刚出生未吃初乳仔猪18头，采用人工哺乳，随机分成两组，治疗组12头，对照组6头，适应24小时后攻毒，仔猪开始出现腹泻时治疗组口服提纯卵黄抗体液，每猪每次2ml，每日3次；对照组口服等量生理盐水。逐日观察，以粪便指数和死亡率两个指标反映治疗组和对照组差异是否显著。粪便指数按照Sherman等制定的标准判定，即0分为正常，粪便固态成形；1分为轻度腹泻，粪便稀软成形；2分为中度腹泻，粪便呈黄色水样；3分为重度腹泻，粪便呈水样喷射。

2结果

2.1血清抗体和卵黄抗体效价检测 结果显示，二免后1周血清抗体较卵黄抗体效价高，血清抗体效价上升快，至三免后2周达到峰值，之后其效价快速下降；而卵黄抗体效价上升较慢，三免后3周达到峰值，之后其效价缓慢下降，较血清抗体维持2.2卵黄抗体浓度、纯度和效价测定 卵黄经氯仿去脂后蛋白浓度为14.5mg/mL ,经硫酸胺沉淀并透析后蛋白浓度为10.2mg/mL;SDS-PAGE蛋白质电泳(图2)显示不同方法处理后卵黄抗体纯度明显提高，卵黄抗体由分子量约为66kd和35kd的重链和轻链组成，与文献报道一致；氯仿去脂后琼扩效价为1∶8，而透析后上升至1∶64。

2.3卵黄抗体抗病毒活性测定 攻毒后12－24小时所有仔猪均出现不同程度的黄色水泻，治疗组在口服卵黄抗体液后腹泻症状逐渐减轻，4-5天后基本恢复正常，死亡率仅16.7%；而对照组腹泻呈水样喷射，死亡主要出现在攻毒后2-3天，死亡率为100%，两者差异极显著。结果见表1。

表1 仔猪攻毒治疗后不同天数死亡情况及粪便指数结果

Tab.1 Comparison of mortality rate and fecal scoring between the IgY treatment group and the control group

注：分母为存活仔猪数，分子为腹泻仔猪数；括号内为存活仔猪平均粪便指数。

Note: the numerator/denominator means No. of diarrhea piglets/No. of survival piglets; Numbers within parentheses indicate the mean fecal scoring.

3讨论

猪流行性腹泻病毒感染呈地方流行性，传播较慢但感染后在养猪场持续存在，仔猪母源抗体消失后即发病，死亡率较高，同时排毒和散毒感染陆续出生的仔猪，抗生素治疗无效。本实验研制的卵黄抗体经口服后在肠道内与PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感染，同时病毒排出体外后失去感染力，对该病流行也有一定的抑制作用。目前国内尚未见针对PEDV卵黄抗体研制的报道。

本试验采用氯仿去脂和硫酸胺沉淀来提纯卵黄抗体，卵黄经氯仿处理后易于去除脂类和不溶性蛋白，上清液澄清透明，再利用盐沉淀可进一步提纯和浓缩抗体，操作简单方便，抗体纯度高，缺点是处理样品量少，氯仿造成环境污染。

血清抗体和卵黄抗体效价比较结果显示，免疫后血清抗体效价先上升，到达峰值后下降也较快；卵黄抗体效价上升稍慢，但达到峰值后常维持较长时间，下降也较慢；但血清抗体和卵黄抗体效价总的变化趋势是一致的。

卵黄抗体的分子量约为180kd，由两条重链和两条轻链组成，本实验蛋白质电泳结果显示两条蛋白条带分别为66kd的重链和35kd的轻链，说明我们已提纯制备了卵黄抗体。

通过仔猪攻毒和卵黄抗体治疗试验显示，口服卵黄抗体的仔猪得到了有效保护，说明卵黄抗体具有明显的抗病毒活性，可以应用于PEDV感染仔猪的治疗。

猪场一旦发生PED，目前尚没有特别有效的防治措施，因而该病应以预防为主，在加强养猪场综合预防措施的同时，在有猪流行性腹泻发病史的猪场，给妊娠母猪注射弱毒疫苗，新生仔猪添加卵黄抗体，对防治该病将具有重要意义。