猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属的成员，根据抗原性及基因组成，分为PCVl和PCV2两种，其中PCV2对猪具有致病性，于1998年首次从患断奶后多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PM-WS)的病猪体内分离出来。近年来，猪圆环病毒病的发生呈上升趋势，加拿大、美国、法国、英国等国家都报道了PMWS的发生和流行，国内也不断有关于PCV2以及与其他病原体混合感染的报道。PCV2主要侵害免疫系统，导致感染猪免疫抑制，降低机体对其他病原体的抵抗力和疫苗的反应性，容易导致其他病毒和细菌的继发感染，使死亡率明显升高，给养猪业造成巨大的经济损失。
为了解该病在河北省尤其冀东地区及其临壤京津地区的流行情况，在2006年9月至2007年10月期间，采用间接ELISA方法对迁安、滦南、抚宁、廊坊、宁河、大兴等9个县(市)的22个猪场的398份猪血清检测了PCV2抗体并进行了分析，同时用PCR方法对部分样品进行了病原学检测。
1材料与方法
1．1待检血清样品
样品采自冀东、北京、天津部分地区的11个规模猪场和ll个散养户，共采集血清398份，其中繁殖母猪、后备母猪86份，种公猪17份，育肥猪149份，断奶仔猪146份。耳静脉或前腔静脉采血，分离血清，-20℃保存备用。
1．2主要试剂
猪圆环病毒病ELISA诊断试剂盒，购自华中农业大学动物医学院动物病毒研究室；蛋白酶K，购自Merck公司；Tris饱和酚，购自鼎国生物技术公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs等购自北京天为时代科技有限公司。
1．3 引物
上游引物U：5 ’-AGT GAG CGG GAA AAT GCAGA-3’，下游引物L：5’-TCC TCC GTG GAT TGT TCTGT-3 ’，由上海生工生物技术有限公司合成。
1．4血清抗体的ELISA检测
按照猪圆环病毒病间接ELISA检测试剂盒说明进行抗体检测。
1．5血清样品中PCV2核酸的PCR检测
1．5．1 DNA的提取
从ELISA检测阳性的血清样品中随机取14份用于PCV2 DNA提取。DNA提取过程如下：取300
μL血清，加入等体积的组织裂解缓冲液，再加入蛋白酶K(20 mg／mL)至终浓度50μg／mL，于50℃消化2 h；取出消化产物，加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀后，4℃12 000 r／min，离心10 min；取上层水相500 μL转入l支1．5 mL Eppendorf管中，加入等体积的酚．氯仿．异戊醇混合液，混匀后，4℃12 000 r／min，离心10 min；取上层水相400 μL转入另1支1．5 mL Eppendorf管中，加入800μL预冷无水乙醇和3 mol／L NaAc(pH 5．2)40斗L，在一20℃放置l—2 h或室温放置30 min以沉淀病毒DNA；4 ℃ l2 000 r／min，离心10 min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，自然干燥后溶于20汕灭菌蒸馏水中，立即用于PCR反应或一20℃保存备用。
1．5．2 PCR扩增
PCR反应体系为50μL，包括10×PCR缓冲液5μL，10 mmol／L dNTPs 4μL，5 U／μL Taq DNA聚合酶lμL，25 pmol／L上、下游引物各1 μL；DNA模板3μL，无菌去离子水38μ L。PCR扩增条件为94℃预变性3 min；94℃变性45 S，56 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸l0min。DNA产物用1．2％琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果
2．1血清抗体的ELISA检测
共检测了22个猪场(含散养户)，除了2个散养户外，被检养猪场均有不同程度的PCV2感染，阳性猪场数为90．9％；被检测的398份血清中，检出PCV2抗体阳性血清335份，PCV2抗体的平均阳性率为84．2％，猪场最高感染率达93．2％，最低为62．2％。被检的血清样品中种母猪抗体阳性率为86％，种公猪抗体阳性率为88．2％，育肥猪抗体阳性率为85．2％，断奶仔猪抗体阳性率为76．7％，呈现出PCV2感染随猪年龄增长而升高的趋势，这与郎洪武等的报道相一致。抗体检测结果详见表l、2。
2．2 PCV2的PCR检测
对随机选取的l4份PCV2抗体阳性的猪血清进行了PCR检测。结果，从6份血清中扩增出了预期长度为417 bp片段。结果见图1。
3讨论
本试验主要从秦皇岛、唐山、北京及天津地区的11个规模养殖场和11个散养户中随机采集猪血清样本进行PCV2病原和抗体检测，涉及到了不同类型的猪场，具有一定的区域代表性。从不同猪场不同年龄段猪的PCV2抗体检测结果来看，被检猪场有不同程度的PCV2感染，平均抗体阳性率为84．2％，其中种母猪抗体阳性率86％，种公猪抗体阳性率88．2％，育肥猪抗体阳性率85．2％，断奶仔猪抗体阳性率76．7％，断奶猪的阳性率随年龄增长而升高。母猪的阳性检出率明显高于断奶仔猪、育肥猪，但是否与种猪带毒、持续感染、垂直传播以及抗体消长等有关还有待进一步揭示。平均抗体阳性率高于2004年李鹏等报道的河北省规模养猪场PCV2总抗体阳性率76．8％的结果，这在一定程度上反映了PCV2感染率上升的趋势。
近年来猪价居高不下，养猪效益高，大量从外地引进猪只，贸易交流频繁，检疫不严，加之饲养管理较粗放，兽医卫生制度不健全是本病广泛存在和流行的主要原因。散养户的抗体阳性率较高(92．6％，50／54)，这与笔者在平时猪病检验中发现的规律相吻合。散养户进猪途径较广，往往将不同来源仔猪混合饲养，容易将病原引进并造成扩散。因此，应提倡自繁自养、全进全出的饲养方式，或采用美国的分点式和合同式养猪生产模式更有利于对圆环病毒感染和猪繁殖与呼吸综合征等疾病的控制。
鉴于目前猪病容易混发、病原复杂的实际情况，在对上述猪场进行流行病学调查基础上，选取调查猪场中具有疑似PCV2感染临床表现且PCV2血清抗体阳性的猪只，采用PCR方法对病原进行了检测。结果显示，在14份被检血清中检出阳性样品6份，分布在6个猪场。这一检测结果进一步证实了PCV2感染引起的猪病的客观性及危害性，也在一定程度上表明了PCV2感染中抗体阳性率与PCV2持续性感染之间的关系，二者的相关性有待进一步研究。但据有关资料介绍，猪单纯感染PCV2病毒，仅产生温和的临床症状，很少死亡，临床上多与PRRSV或PPV等混合感染，这可能由于圆环病毒使机体免疫功能受到抑制，从而引起其他病的继发感染或并发感染，但究竟PCV2与PRRSV、PPV发病机理上的相关性如何，尚需进一步研究。
PCV2在猪群中的高感染率已经对养猪业的发展构成了威胁，应尽快研究有效防治措施。目前还没有切实可行的能够完全控制和消灭PCV2感染的方案，采取一般防疫措施可以降低该病造成的损失。例如科学饲养管理，减少各种应激；严格检疫制度，定期监测，及时淘汰阳性猪只；商品猪场尽量从同一个健康繁殖猪场进猪并合理分群，以减少和降低猪群之间PCV-2及其他病原的接触感染机会；有效预防和控制其他感染性疾病，做好猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征等疫苗的免疫接种，提高猪群整体的免疫水平。
展开全文